基于MicroRespTM不同施肥方式对土壤微生物群落的影响

王 飞， 秦方锦， 王先挺， 翁 颖， 林 辉

(1.宁波市种植业管理总站， 浙江 宁波 315000； 2.鄞州区农业技术服务站， 浙江 宁波 315100； 3.慈溪市农业监测中心， 浙江 宁波 315300； 4.浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所， 浙江 杭州 310021)

土壤微生物群落是土壤生态系统最为重要和活跃的功能组分，在驱动土壤有机质分解、养分循环等方面有着重要作用[1]。由于对土壤环境条件变化敏感，土壤微生物群落功能多样性也常被用作评价土壤质量和健康状况的重要生物学指标[2-4]。随着土壤微生物研究方法的发展，许多新技术被引入土壤微生物群落功能多样性研究中，其中MicroRespTM技术是一种基于土壤微生物代谢功能研究土壤微生物生态的方法，因其测定具有简单、灵敏和快捷等优点而被越来越多地应用于土壤微生物群落功能多样性研究[5-6]。

施肥是农业中最为重要和普遍的增产手段，不同施肥方式不仅影响土壤养分循环和土壤肥力，对土壤微生物活性、群落结构及功能多样性也会产生影响。有研究表明不同施肥条件下土壤酶活性和微生物群落功能多样性的差异较大，土壤脲酶和脱氢酶活性可作为土壤肥力的指标[7]。罗希茜等[8]研究结果表明，不同施肥对土壤微生物功能多样性产生不同影响，从而影响土壤有机质中碳、氮含量。虽然土壤生态功能变化和微生物群落响应正逐渐成为施肥方式研究的热点，但以往研究主要集中在土壤生物碳、土壤酶和土壤理化性质等方面[9-11]，对于长期定位观测不同施肥方式对土壤微生物群落功能特性的影响关注较少。笔者基于5 a定位试验，采用MicroRespTM技术研究长期施用有机肥、沼液肥和化肥配施有机肥或沼液肥等不同施肥方式下土壤微生物代谢功能差异，旨在探索不同施肥方式对土壤微生物群落功能的影响，为当地选择适宜的施肥模式来提高耕地土壤质量和实现耕地永续利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区设在东吴镇生态农业园(29°49′48.8″ N，121°43′53.5″ E)，位于鄞州区东部水网平原，属亚热带季风性湿润气候区，因濒临东海而且有海洋性气候特征。该地区年均日照2 070 h，年均太阳辐射461.4 kJ·cm-2，年均温度16.2 ℃。该地区年均降水量1 538.8 mm，年均雨日174 d，年均相对湿度82.4%[12]。试验点地势平坦，常年种植单季水稻。供试田块土壤类型为脱潜水稻土，黄黏田亚类，青紫泥田土种，质地为壤土。试验前耕层土壤pH值为5.33，w(有机质)为11.2 g·kg-1，w(碱解氮)、w(有效磷)和w(速效钾)分别为13.8、2.27和48.6 mg·kg-1。

1.2 试验设计

于2011年在园区设置不同施肥方式的5 a连续定位试验点，共设6个处理：不施肥对照(CK)、纯化肥(NPK)、纯有机肥(HOM)、中量有机肥+化肥(MOM)、纯沼液肥(HBS)和中量沼液肥+化肥(MBS)。各处理施肥方式见表1，其中纯化肥区施肥量(N、P2O5和K2O用量分别为249、63和13 kg·hm-2·a-1)按测土配方施肥法确定，纯有机肥区和纯沼液肥区施肥量按当地习惯施肥确定，中量肥区施肥用量减半。各处理面积为666.7 m2，不设重复。

表1各处理施肥方式

Table1Designoffertilizationsystemkg·hm-2·a-1

“—”表示无数据。CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。

供试化肥为当地农资市场优品肥料，有机肥为当地生产的猪粪源商品有机肥，沼液肥由附近猪粪源沼气工程物流配送。所投入有机肥和沼液肥氮磷钾养分和重金属含量及其年带入量见表2～3，商品有机肥料符合NY 525—2012《有机肥料》的重金属限量，沼液肥在国内尚无相应重金属限量标准。参照GB 5084—2005《农田灌溉水质标准》，部分年份沼液肥镉、铜和锌含量超标。

表2有机肥和沼液肥的pH值和氮磷钾养分含量

Table2pHvalueandnitrogen,phosphorusandpotassiumcontentoforganicmanureandbiogasslurrymanure

肥料种类pH值w(N)/(g·kg-1)w(P205)/(g·kg-1)w(K2O)/(g·kg-1)有机肥7.28～8.091.930～2.7802.240～6.0101.680～2.820沼液肥7.65～8.140.040～0.0510.008～0.0170.024～0.046

1.3 土样采集与处理

于2015年12月单季稻收获后按“S”形分别使用约5 cm孔径取土器采集各处理0～20 cm耕层土样，采集时每10点混合组成一个代表土样，每个处理采集3个代表土样，6个处理共采集18个代表土样装入塑封袋并置于冰块上带回实验室。新鲜土样剔除动植物残体后，过2 mm孔径筛，4 ℃条件下冷藏保存，1周内完成MicroRespTM分析。具体取样方法执行NY/T 1121.1—2006《土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存》[13]。

1.4 分析方法

采用MicroRespTM方法进行土壤微生物群落功能分析。MicroRespTM是一种基于土壤微生物代谢功能反映土壤微生物群落的测定方法，利用土壤在不同碳源诱导下的CO2产生情况来表征原位土壤微生物群落水平的生理特征[14]。操作步骤如下：

(1)预培养活化微生物：根据土壤含水率，将4 ℃ 条件下冷藏保存的土壤样品湿度调至20%～30%，均匀称取50 g至烧杯中，25 ℃条件下密封预培养4 d。

(2)检测微孔板制备：将甲酚红(12.5 mg·L-1)、氯化钾(150 mmol·L-1)和碳酸氢钠(2.5 mmol·L-1)混合形成的指示剂，溶解在0.03 g·mL-1纯化琼脂(sigma)中，混合均匀后取150 μL指示琼脂填加到检测板微孔中，配制好的检测板存放在含有湿巾和碱石灰的避光干燥器皿中待用，以防变干或与空气中的CO2反应。

(3)检测：将待测土样均匀填加到96孔深孔板中，并在每个深孔板中按照一定顺序添加16种碳源底物：水、L-丙氨酸、L-阿拉伯糖、精氨酸、半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、γ-氨基丁酸、L-赖氨酸、L-苹果酸、N-乙酰葡糖胺、草酸、原儿茶酸和海藻糖分别为0、30、30、30、30、30、30、30、30、30、30、30、7.5、30、7.5和30 mg·g-1。将检测板倒扣在深孔板上，用专用夹子固定，在25 ℃条件下培养6 h。在酶标仪570 nm波长下测定检测板在土样培养前及培养6 h后的吸光值，利用吸光值变化计算CO2产生率(%)。

CO2产生率和吸光值通用标准化计算公式[15]为

(1)

ρCO2=a+b/(1+d×Ai) ，

(2)

WCO2=(ρCO2/100)×L×(44/22.4)×

(12/44)×[273/(273+T)]/(W×U)/t。

(3)

表3有机肥和沼液肥重金属残留量及年带入量

Table3Theresidualconcentrationofheavymetalsinorganicmanureandbiogasslurrymanureandtheannualinputofheavymetalsintosoil

重金属商品有机肥沼液肥残留含量1)/(mg·kg-1)HOM年带入量/(mg·hm-2·a-1)MOM年带入量/(mg·hm-2·a-1)残留含量/(mg·L-1)HBS年带入量/(mg·hm-2·a-1)MBS年带入量/(mg·hm-2·a-1)总镉(Cd)0.62～1.36 13 950 15 300.00.004 5～0.012 1 101.25 136.125总铬(Cr)2.29～16.6351 525187 087.50.038 4～0.098 4864.001 107.000总汞(Hg)0.22～0.754 9508 437.5未检出00总铅(Pb)5.26～8.95118 350100 687.50.001 0～0.012 322.50138.375总砷(As)0～15.040169 200.0未检出00总铜(Cu)652.46～786.7314 680 3508 850 712.50.211 9～1.254 64 767.7514 114.250总锌(Zn)2 102.33～2 377.184 730 242526 743 275.01.105 7～2.363 424 878.2526 588.250

HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。1)以烘干基计。

1.5 数据处理

Shannon-Wiener多样性指数、Shannon-Wiener均匀度指数和Simpson多样性指数是表征土壤微生物群落多样性常用指数，不同的多样性指数可以表征土壤微生物多样性的不同方面。Shannon-Wiener多样性指数能反映土壤微生物群落利用碳源类型的多与少，即功能多样性，指数值越高，表明该系统土壤微生物群落功能多样性越高。Shannon-Wiener均匀度指数可度量群落物种均一性，均匀度指数越大，种类之间个体分配越均匀，生物多样性就越高[16]。Simpson多样性指数也可用于判断群落多样性，群落中物种越多,各个体分配越均匀，Simpson指数就越高，群落多样性也越高[17]。Shannon-Wiener物种丰富度指数、Shannon-Wiener均匀度指数和Simpson多样性指数计算方法参照文献[18]。

试验数据采用Excel 2004和SPSS 15.0软件处理，差异显著性分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差法(LSD)，作图采用SigmaPlot 10.0软件，聚类分析采用SPSS 15.0软件。

2 结果与讨论

2.1 不同施肥方式下土壤理化性质和重金属累积

5 a不同施肥方式下土壤理化性质和重金属残留情况见表4。从土壤理化性质上看，有机肥处理(HOM和MOM)和沼液处理(HBS和MBS)土壤pH值、有机质含量和氮磷养分含量有明显提高，但沼液提高效果不如有机肥，此与以往研究报道[17]基本一致。从重金属残留上看，与CK土壤相比，沼液处理(HBS和MBS)土壤重金属含量无明显变化，表明该施肥方式没有明显造成土壤重金属累积；而有机肥处理(HOM和MOM)除土壤Hg、As、Pb、Cd、Cr和Ni含量较CK无明显变化外，Cu和Zn含量有显著增加(P<0.05)，且HOM处理少量土样Zn含量少量超标(标准限值为200 mg·kg-1)[19]。这与各施肥方式的重金属年带入量有关，有机肥处理重金属年带入量明显较沼液处理高，但各处理土壤重金属累积量基本在限值内。

表4不同施肥方式下土壤理化性质和重金属残留量

Table4Soilpropertiesandheavymetalresiduesunderdifferentfertilizationregimes

处理w(有机质)/(g·kg-1)w(全氮)/(g·kg-1)w(碱解氮)/(mg·kg-1)w(有效磷)/(mg·kg-1)w(速效钾)/(mg·kg-1)w(全磷)/(g·kg-1)w(全钾)/(g·kg-1)pH值w(全盐量)/(g·kg-1)CK4.41±0.10d0.29±0.04b229±4bc18.3±2.4d103±14b0.71±0.08c17.0±0.7a5.2±0.2de0.66±0.08bcHOM5.63±0.15a0.38±0.01a273±16a91.8±13.5a187±61a1.54±0.25a17.1±1.2a5.9±0.0a0.94±0.15aMOM5.20±0.43b0.35±0.02a249±26ab58.3±2.5b127±25b1.13±0.16b16.2±0.3a5.6±0.1b0.78±0.05bNPK4.59±0.23cd0.31±0.02b219±9c8.8±2.7d106±16b0.68±0.13c16.4±1.2a5.1±0.1e0.41±0.04dHBS4.95±0.18bc0.38±0.01a243±4bc44.4±12.3bc125±24b0.85±0.14c16.0±0.8a5.4±0.1bc0.63±0.07cMBS5.05±0.16b0.37±0.01a248±12ab37.8±9.5c122±23b0.84±0.07c16.0±0.7a5.3±0.1cd0.53±0.07cd处理w(总重金属)/(mg·kg-1)w(Hg)/(mg·kg-1)w(As)/(mg·kg-1)w(Pb)/(mg·kg-1)w(Cd)/(mg·kg-1)w(Cr)/(mg·kg-1)w(Cu)/(mg·kg-1)w(Zn)/(mg·kg-1)w(Ni)/(mg·kg-1)CK279±4c0.26±0.04a4.80±0.11ab53.3±1.4a0.27±0.02a56.6±0.3ab32.7±1.0de111±4cd20.2±0.5abHOM406±12a0.26±0.06a4.51±1.23ab48.6±2.9b0.28±0.02a59.8±2.6ab63.2±1.9a208±10a21.3±1.1aMOM339±8b0.25±0.03a3.97±0.94b48.1±3.6b0.32±0.03a64.0±2.7a48.6±1.6b154±7b20.1±0.9abNPK267±13c0.28±0.04a5.32±0.44a48.8±0.8b0.27±0.00a58.9±11.4ab31.2±0.9e100±2d21.8±1.0aHBS279±19c0.28±0.03a4.93±0.26ab51.1±1.0ab0.28±0.03a47.7±11.9b38.2±1.7c115±5c20.7±0.4abMBS279±8c0.30±0.03a4.57±0.21ab50.4±3.0ab0.29±0.06a50.4±7.4b34.3±2.2d119±9c19.1±2.0b

CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。同列数据后英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.2 不同施肥方式对土壤微生物代谢活性及其群落功能多样性的影响

土壤微生物基础呼吸CO2产生率表征土壤微生物群落对碳源底物的利用能力，是反映土壤微生物代谢活性的有效指标。MicroRespTM测定结果显示，CK、HOM、MOM、NPK、MBS和HBS处理CO2产生率分别为0.51、0.79、0.75、0.4、0.61和0.36 μg·g-1·h-1(图1)。除HBS处理外，其他处理土壤呼吸强度均高于或显著高于CK和NPK。可见，不同施肥方式对土壤微生物代谢活性产生明显差异。其中，施用有机肥或有机肥、沼液肥配施化肥可促进土壤呼吸作用。这与文献[9-11]的研究结果相近。分析认为，适量施用有机肥或沼液肥能增加土壤有机碳含量，进而通过提高土壤微生物生物量及活性增强土壤呼吸强度。也有研究[20]指出，重金属对土壤基础呼吸作用存在浓度效应，重金属胁迫可刺激土壤CO2释放，尤其是Cu和Zn。该研究中有机肥施用后土壤Cu和Zn含量明显增加也支持了这一论点。此外，长期高量施用沼液肥导致土壤呼吸降低，表明该施肥方式对土壤微生物代谢活动具有抑制作用，这可能是由于长期施用大量单一沼液使土壤微域环境发生改变，从而对土壤微生物适宜性造成影响，致使土壤微生物代谢活性下降。

CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间CO2产生率差异显著(P<0.05)。图1 不同施肥处理对土壤平均CO2产生率的影响Fig.1 Effects of different fertilization treatments on the average production rate of soil CO2

不同施肥方式下Shannon-Wiener多样性指数、Shannon-Wiener均匀度指数和Simpson多样性指数见表5。各处理Shannon-Wiener多样性指数和均匀度指数变化趋势表现一致，由大到小依次均为MOM、NPK、CK、HOM、MBS和HBS处理。经差异显著性分析，HOM、MOM和NPK处理与CK无显著差异(P>0.05)，而HBS处理显著低于CK(P<0.05)。此外，从Simpson多样性指数上看，HBS处理也显著

低于CK及其他处理(P<0.05)。可见，不同施肥方式对土壤微生物群落功能多样性影响也有所不同。首先，MOM和NPK处理3种指数均较大，表明有机肥配施化肥和氮磷钾配合施肥的土壤微生物种类较多，分布较均匀，且对碳源利用程度也较高。这与张逸飞等[7]和孙瑞等[21]的研究结果类似。分析认为这是由于有机肥和矿物质肥料本身为土壤微生物提供了较多营养物质，有利于土壤微生物均衡生长，提高物种丰富度和优势度[22]。其次，该研究中HBS处理各指数均最低，这与李轶等[23]研究发现单施沼液会降低土壤微生物群落多样性的结果吻合，这可能是由于长期单一施用沼液会促进某些微生物种群生长代谢，但对其他微生物种群生长代谢产生抑制作用，致使土壤微生物群落多样性下降。

表5不同施肥方式下土壤微生物群落功能多样性指数

Table5Functionaldiversityindicesofthesoilmicrobialcommunitiesunderdifferentfertilizationregimes

处理Shannon-Wiener多样性指数Shannon-Wiener均匀度指数Simpson多样性指数CK2.556±0.003a0.922±0.001a0.912±0.003aHOM2.547±0.006a0.919±0.002a0.914±0.001aMOM2.592±0.019a0.935±0.007a0.920±0.003aNPK2.564±0.018a0.925±0.007a0.914±0.004aMBS2.541±0.017ab0.916±0.006ab0.912±0.003aHBS2.483±0.079b0.896±0.028b0.900±0.012b

CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。同列数据后英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P<0.05)。

2.3 不同施肥方式对土壤微生物群落代谢结构的影响

为探讨不同施肥方式土壤微生物群落代谢结构变化，对不同碳源底物呼吸速率数据进行聚类分析。如图2所示，6个处理可分为2个聚类簇，HOM和MOM处理土壤微生物群落代谢结构相似度较高，聚为一簇(聚类簇1)，其余处理聚为另一簇(聚类簇2)。进一步分析聚类簇2中各处理发现，MBS处理与其他处理的距离较大，表现出较不同的土壤微生物群落代谢结构特征；而HBS和NPK处理土壤微生物群落代谢结构相似度较高，可以推测沼液肥和化肥对土壤微生物群落代谢存在交互影响。综上可知，相较于化肥和沼液肥，有机肥对土壤微生物群落代谢结构的影响更大，这可能与施用有机肥后土壤养分发生变化有关。BAUSENWEIN等[24]认为微生物群落结构主要受有机质调控。WAKELIN等[25]研究也发现微生物群落结构改变与碳、氮、钾和钠有关。该研究中施用有机肥后土壤有机质和氮钾养分含量明显提高也支持了这一论点。

CK1～3为对照处理3个样本，NPK1～3为纯化肥处理3个样本，HOM1～3为纯有机肥处理3个样本，MOM1～3为中量有机肥+化肥处理3个样本，HBS1～3为纯沼液肥处理3个样本，MBS1～3为中量沼液肥+化肥处理3个样本。图2 不同施肥方式下土壤微生物群落代谢结构的分层聚类分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of the metabolic structure of soil microbial community under different fertilization regimes

2.4 土壤理化性质及重金属累积与土壤微生物群落代谢的关联分析

通过将土壤理化性质及重金属因子与土壤微生物代谢活性及群落多样性进行相关分析(表6)发现，土壤理化性质(除全氮、全钾外)和重金属总残留量分别与土壤微生物呼吸速率呈极显著或显著正相关，其中以土壤pH值及全盐量、全磷、Cu和Zn含量与土壤微生物呼吸作用的关系最密切，相关性较高(R2>0.7)。此外，各土壤理化因素和重金属因子中，仅有土壤Cr含量与Shannon-Wiener多样性指数呈显著正相关，但相关性不高(R2=0.569)，表明在较低浓度范围内提高土壤Cr含量水平可能增加土壤微生物群落类型。

综上，HOM和MOM处理使土壤微生物呼吸强度增加可归结于土壤pH值提高及全磷、Cu和Zn含量增加，其中土壤Cu含量是主要影响因子，表明土壤中Cu含量变化会改变土壤微生物群落代谢利用行为。这与郭星亮[26]研究结果一致，Cu可提高微生物群落对高聚物类碳源的转化利用，但也证实高剂量Cu则会产生一定抑制作用。另外，由于土壤微生物群落代谢多样性仅与土壤Cr含量呈显著相关(P<0.05)，可知MOM与HBS处理土壤代谢群落多样性存在较大差异可能是由于两者Cr含量不同所致，但相关性不高，这可能是因为土壤微生物群落代谢多样性受土壤微生物生物量碳等其他重要因素影响，尚有待进一步研究。

表6土壤微生物生物量与土壤理化性质及重金属因子的相关系数

Table6Correlativecoefficientsbetweensoilmicrobialbiomassandsoilpropertiesorheavymetalfactors

微生物群落代谢指标w(有机质)w(全氮)w(碱解氮)w(全磷)w(有效磷)w(全钾)w(速效钾)pH值全盐量CO2产生率0.548*0.3850.568*0.752**0.773**0.2050.534*0.794**0.789**Shannon指数-0.008-0.272-0.1340.1150.0440.3360.0870.0970.241微生物群落代谢指标w(Hg)w(As)w(Pb)w(Cd)w(Cr)w(Cu)w(Zn)w(Ni)w(总重金属)CO2产生率-0.368-0.448-0.1580.3600.2940.855**0.791**0.2220.812**Shannon指数-0.245-0.001-0.279-0.1370.569*0.2250.1490.2060.244

n=18。*表示相关显著 (P<0.05)，* *表示相关极显著(P<0.01)。

采用基于距离的线性模型(distance-based linear modelling，DistLM)研究土壤微生物群落代谢结构与土壤理化性质及重金属分布相关性(表7)。

表7土壤微生物群落代谢结构与土壤理化性质及重金属的DistLM分析

Table7Distance-basedlinearmodelling(DistLM)analysisofsoilmicrobialcommunitymetabolismstructurewithsoilpropertiesandheavymetals

影响因子SSP影响因子SS Pw(有机质)1 190.80.037w(Hg) 766.30.093w(全氮)888.00.069w(As)595.70.195w(碱解氮)997.20.052w(Pb)440.20.308w(全磷)1 993.80.001w(Cd)442.90.308w(有效磷)1 995.70.001w(Cr)664.40.145w(全钾)251.10.630w(Cu)2 583.00.001w(速效钾)951.40.039w(Zn)2 177.30.001pH值2 193.20.001w(Ni)486.90.261全盐量2 100.80.001

SS为离均差平方和。

各土壤重金属因子中，仅有Cu和Zn含量对土壤微生物群落代谢结构变化产生极显著影响(P<0.01)，其中土壤Cu含量是造成微生物群落代谢结构差异最根本影响因子〔离均差平方和(sum of squared deviations from mean，SS)为2 583.0〕。各土壤理化指标中，pH值、全盐量、有机质、有效磷和全磷含量等可极显著解释土壤微生物群落代谢结构变化(P<0.01)，其中土壤pH值(SS为2 193.2)、全盐量(SS为2 100.8)、有效磷含量(SS为1 995.7)、全磷含量(SS为1 993.8)和有机质含量(SS为1 190.8)对微生物群落代谢结构产生差异的贡献较大。

通过基于距离的冗余分析(distance-based redundancy analysis，dbRDA)方法进一步分析土壤理化性质及重金属因子对微生物群落代谢功能多样性影响发现，不同施肥方式下土壤微生物群落功能多样性呈现不同空间分布特征，各影响因子中最主要的为土壤Cu含量，其次是土壤pH值、全盐量和全磷含量(图3～4)，这与DistLM分析结果基本一致。

CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。圆圈内处理相似性较高。图3 不同施肥方式下土壤微生物代谢功能与重金属含量的dbRDA分析排序Fig.3 dbRDA analysis of microbial metabolic function and heavy metals with different fertilization regimes

CK为对照处理，NPK为纯化肥处理，HOM为纯有机肥处理，MOM为中量有机肥+化肥处理，HBS为纯沼液肥处理，MBS为中量沼液肥+化肥处理。TK、TN、TP、TOM、AN、AP和AK分别为全钾、全氮、全磷、有机质、碱解氮、有效磷和速效钾，TS为全盐量。圆圈内处理相似性较高。图4 不同施肥方式下土壤微生物代谢功能与土壤理化因素dbRDA分析排序Fig.4 dbRDA analysis of the microbial metabolic function and soil properties with different fertilization regimes

3 结论

连续5 a施用高量(22 500 kg·hm-2·a-1)商品有机肥、中量(11 250 kg·hm-2·a-1)商品有机肥或中量(450 000 kg·hm-2·a-1)沼液肥显著提高土壤微生物代谢活性，且仅有施用高量(22 500 kg·hm-2·a-1)商品有机肥、中量(11 250 kg·hm-2·a-1)商品有机肥对土壤微生物群落代谢结构具有明显影响，而施用高量(450 000 kg·hm-2·a-1)沼液肥显著降低土壤微生物代谢活性和群落多样性。据相关性分析表明，土壤微生物群落代谢功能与土壤理化性质及重金属累积有关，土壤pH值、全磷和Cu含量与土壤微生物代谢活性及其结构关系最密切，其中土壤Cu含量为主要影响因子。综上，适量施用有机肥、沼液肥对土壤微生物群落代谢功能有积极作用，且有机肥较沼液肥效果更明显；而长期高量施用沼液肥不利于土壤微生物代谢活性和群落多样性的维持。可见，在当前发展生态循环农业，大力推广有机肥、沼液肥时，必须在监测重金属等污染残留的基础上，关注安全投入用量，形成沼液肥和有机肥的安全使用技术。