头针透刺法对急性脑梗死大鼠CD40与CD40L信号通路的影响

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随着我国居民生活水平不断提高，脑梗死发病率呈现增长趋势，已连续5年成为第二位的死亡原因，且具有极高的致死率、致残率及复发率[1]。急性脑梗死(ACI)是临床常见的神经系统疾病，对人类的生命健康及生存质量造成严重威胁。大量研究表明，脑血管病经抢救存活者，大部分留有不同程度的致残性后遗症，如半身不遂、构音障碍、智力减退等，严重影响病人回归家庭、工作和社会，带来经济和精神的双重压力[2]。目前临床治疗急性脑梗死的主要手段为溶栓，其目的是恢复病变组织的血流及挽救缺血半暗带的血供，但其存在严格的窗口期，在临床受到一定的限制[3]。随着头皮针治疗脑血管病研究的快速发展，早期或超早期针灸治疗急性脑梗死已成为针灸界研究方向。本研究根据头穴的归经与主治，以百会透前顶、率谷透悬厘，并手指捻针为治疗方法，观察神经功能缺损情况、CD40与CD40L表达量与凋亡关系，探讨头针透刺法对脑组织神经细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性健康Wistar大鼠[湖北省实验动物研究中心，合格证号：SCXK(鄂)2008- 0005]60只，体重200 g±20 g。所有大鼠均在实验室常规饲养适应1周，采用随机数字表分为头针透刺组、模型对照组和假手术组，各组又分为7 d和14 d两个亚组，每个亚组10只大鼠，用苦味酸标记并编号。

1.2 实验主要试剂与仪器 华佗牌无菌针灸针(规格：0.20 mm×25 mm，标准号：GB2024- 1994，苏州医疗用品厂有限公司)，酶联免疫吸附法测定(ELISA)试剂盒(美国R&D System公司提供，晶美生物工程有限公司)；浓缩型兔抗人CD40与CD40L单克隆抗体(一抗)、酶标抗鼠/兔聚合物(二抗，购自上海雅吉生物科技有限公司)；即用型免疫组化Elivision TM plus试剂盒、DAB显色试剂盒及磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS；购自上海一研生物科技有限公司)，sCD40L浓度单位为ng/mL，灵敏度0.156。一端经过石蜡制备后的钓鱼线(长度为15 mm)。低速控温离心机(上海赵迪离心机设备有限公司)，医用低温电冰箱、水浴箱、酶标仪、切片机(德国ZEISS公司)、光学显微镜(美国)。

1.3 模型制备 参照改良Zea Longa法制备一侧大脑中动脉阻塞(MCAO)动物模型[4]。术前准备及手术步骤：术前禁食不禁水12 h，随后称重计数。用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mL/kg)，大鼠麻醉后将其固定于操作台上，颈部常规备皮消毒后，取颈前左旁中切口，剪开阔筋膜，显露左侧胸锁乳突肌，从胸锁乳突肌和颈前部肌群间向深部分离即达到颈总动脉(CCA)，用血管钳将皮肤及皮下组织向两侧牵开，用眼科镊子小心游离左侧CCA、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)；结扎ECA及CCA近心端，不剪断ECA，不结扎翼腭动脉，以动脉夹夹闭ICA；用5- 0头皮针于CCA结扎的远心端(距CCA分叉处2 mm～3 mm)刺一小口导入栓塞线，松开ICA动脉夹，调整插线方向及角度，栓线经CCA顺利进入ICA，直至大脑前动脉起始部，遇到阻力停止，长度20 mm～22 mm，用缝合线系住栓塞线；确认无出血后逐层缝合皮肤，伤口局部外用青霉素消炎。假手术组仅分离各动脉而不结扎插线，大鼠苏醒后，有以下表现即表示造模成功：提尾时左侧前肢内收屈曲；右眼Horner征；爬行时向左侧划圈；左侧肢体的疼痛回缩或消失，均可列入实验研究。依照Zea- Longa 5级评分法[5]，0分：无神经功能缺损症状；1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺损，向对侧划圈；3分：重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平下降。选取1分～3分大鼠纳入实验，其余剔除，并随时补足实验所缺大鼠，保证实验大鼠例数。

1.4 干预方法 头针透刺法：透刺穴位均按照华兴邦制定《动物针灸穴位图谱》[6]，选取大鼠百会穴、前顶穴、率谷穴和悬厘穴。大鼠造模成功24 h后，将其仰卧并固定于操作台上，实施头针透刺法。具体操作方法：首先常规皮肤消毒，用0.20 mm×25 mm毫针，取百会向前透刺1.5寸至前顶穴，病灶侧率谷穴向前下方透刺1.5寸至悬厘穴，并以200 r/min速度捻针，持续捻转3 min，留针30 min，期间捻转3次。刺激时长为每日1次，每次30 min，根据术后时间确定治疗疗程分别为7 d和14 d。其余两组大鼠每日相同时间固定于操作台上30 min，不进行任何干预，疗程与头针透刺组相同。

1.5 取材 大鼠干预最后1 d针刺或固定30 min后，先进行评分，之后迅速脱臼处死，取出大脑，用冰冻PBS清洗组织表面血液，取缺血侧大脑的颞叶组织，石蜡切片，所有蜡块均连续切片为4 μm厚度，每个蜡块切两张，进行HE染色及免疫组化检测。取大鼠股动脉血，用抗凝管进行收集，之后用离心机以2 000 r/min离心10 min，用移液枪吸取中间黄衣层置于EP管内，之后放入-20 ℃冰箱中备用。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 待各组大鼠苏醒后对其进行神经功能缺损评分，治疗后进行神经功能评分，并记录实验数据。

1.6.2 大鼠血清sCD40L测定 采用双抗体夹心ELISA，所有标本收集后严格按照说明书进行操作。

1.6.3 大鼠脑组织病理学观察 将已制备好的石蜡切片进行HE染色，在光学显微镜下进行观察。

1.6.4 采用免疫组化法测定脑组织CD40、CD40L表达[7]将已制备好的石蜡切片，微波修复抗原，之后以浓度为3%的H2O2液室温下孵育10 min以阻断内源性过氧化氢酶活性，PBS冲洗，加入一抗(工作浓度为1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，加入聚合物增强剂，室温孵育20 min，PBS冲洗，加入二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗后，DAB显色，苏木精复染，0.1%盐酸分化，PBS返蓝，常规脱水透明，中性树脂封固。每批次均设阳性对照片1张(由试剂公司提供空白石蜡切片)，PBS液取代一抗作为阴性对照。结果判定：以细胞质内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细胞。阳性细胞符合以下标准：细胞结构清晰可见；棕黄色至深棕色颗粒定位准确；着色明显高于背景，比较清楚。A记分方式：按显色细胞数计分，阳性细胞数<1/3计1分，阳性细胞数为1/3～2/3计2分，阳性细胞数>2/3计3分；B计分方式：按细胞显色深浅计分，无阳性反应细胞计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。总分数=A×B，A×B=0判断为(-)，A×B=1～2判断为(+)，A×B=3～4判断为(++)，A×B=6～9判断为(+++)。至少随机观察5个～10个高倍镜视野(放大倍数为×400)。

2 结 果

2.1 各组Zea- Longa评分比较 头针透刺组评分随治疗时间延长逐渐降低，模型对照组14 d时略有下降。头针透刺组与模型对照组比较，7 d组与14 d组差异均有统计学意义(P<0.05)，表明头针透刺法能显著改善脑梗死大鼠神经功能缺损症状；头针透刺组7 d亚组与14 d亚组评分进行比较，随着时间增加，评分降低，两组差异有统计学意义(P<0.05)，表明头针透刺法对改善脑梗死大鼠行为学有重要作用，且随着时间延长，行为学改善越明显。模型对照组亚组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。此评分为每个亚组最后1 d处置后的评分。详见表1。

表1 各组Zea- Longa评分比较(±s) 分

2.2 各组大鼠血清sCD40L表达比较 假手术组与其他各组相比，sCD40L表达最低，差异有统计学意义(P<0.05)；模型对照组14 d亚组与7 d亚组比较，sCD40L含量略有下降，差异无统计学意义(P>0.05)；头针透刺组14 d亚组与7 d亚组比较，sCD40L含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，且分别与模型对照组两个亚组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组血清sCD40L表达比较(±s) ng/mL

2.3 脑组织病理学观察 假手术组大鼠脑组织无缺血性表现，组织形态正常，细胞排列、结构形态规整，基本无细胞病变及坏死现象。模型对照组7 d亚组大鼠脑缺血区细胞数量明显减少，细胞排列松散，细胞间隙增宽，神经元胞浆及胞膜形态不规则、边界不清，呈缺血样病理改变，可见细胞核明显固缩，空泡样变性坏死数量较多；14 d亚组大鼠脑缺血区神经元细胞稍有增多，固缩和空泡样改变稍减少，细胞间隙改善不明显。头针透刺组7 d亚组大鼠脑缺血区细胞数量减少，细胞排列较松散，神经元胞浆及胞膜形态不规则、边界不清，与模型对照组7 d亚组细胞形态学改变相当；14 d亚组与模型对照组14 d亚组大鼠比较，神经细胞排列层次稍欠整齐，固缩、空泡样变和细胞间隙明显改善，与同组7 d亚组大鼠比较可见神经细胞坏死数量明显减少。头针透刺组中的14 d亚组总体与假手术组相差不大。

2.4 各组大鼠脑组织CD40和CD40L表达比较 模型对照组与假手术组比较，大鼠脑组织CD40、CD40L含量均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；头针透刺组14 d亚组与7 d亚组比较，脑组织CD40、CD40L含量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，且14 d亚组与假手术组14 d亚组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果说明头针透刺法能充分抑制脑梗死大鼠CD40、CD40L的表达，其中以14 d组效果最佳。详见表3、表4。

表3 各组大鼠脑组织CD40表达比较(±s)

表4 各组大鼠脑组织CD40L表达比较(±s)

3 讨 论

急性脑梗死病人起病较急，一般在安静状态下或睡眠时发病，起病后数小时或1 d～2 d内达到高峰。常见的临床症状主要有头痛、眩晕、耳鸣、半身不遂、吞咽困难等，严重时导致昏迷不醒[8]。动脉粥样硬化(atherosclerotic，AS)是导致脑梗死的主要原因，CD40/CD40L过度表达激发免疫和炎症反应，导致粥样斑块内局部炎症细胞浸润，促发斑块破裂，进而发生脑梗死。CD40/CD40L信号通路在AS炎症免疫调节中作用明确，两者相互作用参与AS斑块内主要细胞成分的炎症反应调节[9]。CD40/CD40L是一对互补跨膜糖蛋白，分别属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)及肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，作为炎性和免疫反应的重要信号传导通路，参与调控免疫、炎症、高凝等多种病理状态，可激活炎症反应、活化血小板，导致内皮功能障碍等[10]。CD40/CD40L结合可促进细胞间黏附分子- 1(intercellular adhesion molecule- 1，ICAM- 1)和血管细胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecule- 1，VCAM- 1)表达上调，介导活化血小板或内皮细胞与中性粒细胞和单核细胞黏附，进一步引起血管功能失调和组织损伤。CD40/CD40L系统上调促进炎症反应，为粥样斑块破裂和血栓形成创造有利环境[11]。

目前认为，急性脑梗死所致肢体运动功能障碍，越早进行康复治疗效果越明显[12- 13]。头针是针灸常用的方式，头皮透刺法已广泛应用于缺血性脑病治疗，通过头针应用能有效促进病人大脑局部的血液流通，明显增加受损部位的血流量，促进脑组织功能的恢复[14]。焦顺发[15]认为，大脑皮层的功能与其相对应的头针刺激区密切相关，针刺这些刺激区可调节与其相应的大脑皮层的功能。于致顺研究认为，针刺对大脑神经细胞的电生理功能具有明显调节作用，能恢复抑制的大脑神经细胞兴奋性和中枢传导时间[16]。头皮透刺法目前已广泛应用于缺血性脑病治疗，古人云：“急则用针，缓则用药”“药之不及，针之所为”。《针灸大成》载：“卒暴中风，顶门、百会”“初中风跌倒……，不省人事，牙关紧闭，药水不下，急以三棱针刺手十二井，当去恶血……乃起死回生妙诀”，提出中风早期运用针灸治疗且疗效肯定。中医认为，脑为髓海，元神之府，诸阳之会。头皮针能刺激头部经络，也能刺激大脑皮质功能在头皮的投射区，以促进脑细胞功能恢复[17]。有研究认为，头针可启动大脑两侧血液的代偿机制，调节大脑两侧血液，从而改善脑部供血[18]。

本研究运用头针透刺法对急性脑梗死大鼠进行治疗，选取百会向前透刺前顶穴，病灶侧率谷穴向前透刺悬厘穴。百会透前顶纵跨额顶叶交界处中线，位于大脑前动脉主干投影区，对改善大脑前动脉的血液循环，兴奋皮质运动区、皮质感觉区有重要意义；率谷透悬厘斜行于颞叶、额叶下部，位于大脑中动脉皮层支主干和分支颞前、中、后动脉支配区的投影处，刺激此区域对改善大脑中动脉的血液循环有较好的作用[19]。本实验模型对照组各亚组较假手术组各亚组CD40、CD40L表达明显增多，头针透刺组各亚组较模型对照组各亚组CD40、CD40L表达明显减少，其中以14 d亚组更显著，差异有统计学意义(P<0.05)。证实头针透刺法通过抑制CD40/CD40L炎症信号通路传导，抑制一系列炎症反应，起到保护脑组织作用，最终改善脑梗死大鼠神经功能，提高生存质量。

综上所述，抑制CD40/CD40L表达可能是头针透刺法预处理大鼠脑梗死，抑制神经元凋亡、保护脑组织作用的重要机制之一。关于其他作用机制或途径，需要进一步研究探索。