RP-HPLC测定参附强心颗粒中盐酸多巴胺的含量*

张 翅 吴建国 徐慧燕 唐 莉 朱雅宁 潘德林△

[1.华润三九（雅安）药业有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中医药大学，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137]

参附强心颗粒是以古代经典名方 “参附汤”为依据，在中药大品种参附注射液基础上开发的创新型中药新药，主要由红参、附片两味药材和相应的辅料组成[1]，治疗领域是慢性心力衰竭（CHF）。 CHF 是各种心血管疾病发展的终末阶段[2]，病情复杂，预后不良，成为世界范围重要健康问题[3]。心力衰竭患者的临床表现越典型，经常伴随心力衰竭的许多合并症也越明显，如高血压、房颤、糖尿病、贫血和肾脏受损等，一般病程较长，需要长期服药[4]。现代药理研究表明，盐酸多巴胺为附子的水溶性强心成分，能够加强心肌收缩力以及加快心肌的收缩速度[5]，静脉注射 40 μg/kg 可使大鼠血压升高50%，3 μg/mL则可使豚鼠的右心房和频率分别增加250%和120%[6-7]。盐酸多巴胺在临床上治疗顽固性心力衰竭，其临床效果显著[8-9]，可提高患者的心排血量，降低患者左心室充盈压，改善患者的临床症状，促进患者的治疗和恢复，且并未出现明显的不良反应[10]。本实验旨在建立能够测定参附强心颗粒活性成分之一盐酸多巴胺的高效液相法，以便为更好的控制参附强心颗粒质量提供科学依据。

1 材 料

1.1 仪器 AE-240电子天平（METTLER）；Agilent1 100高效液相色谱仪；AS20500超声仪（SCIENCE）；pH计（SARTORIUS pH-10）；KQ-500 型超声仪（40 KHz，500W）；XP26百万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

JADE-PAK ODS-AQ-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～15 min，100%～97%A。流速 0.6 mL/min，柱温 35 ℃，进样量 10 μL，检测波长 280 nm[11-13]。 理论塔板数按盐酸多巴胺计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备

精密量取盐酸多巴胺对照品5.35 mg，置50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得到质量浓度为107.000 μg/mL的溶液，再精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，即得到质量浓度为10.700 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取参附强心颗粒4.1634 g，加pH等于1的盐酸水100 mL超声溶解，得到质量浓度为41.634 mg/mL供试品溶液。取适量供试品溶液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按照“2.1”项下方法进行检测。

2.4 阴性对照溶液的制备

取除附片药材外的其余药材按处方比例和工艺条件制成缺附片阴性样品，再按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.5 检测波长的选择

采用紫外分光光度计对盐酸多巴胺对照品溶液在波长210～400 nm[6]的范围内进行扫描，结果表明盐酸多巴胺对照品溶液在波长280 nm处有最大吸收，与文献一致。故选择波长280 nm为测定波长。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性范围考察 见表1，图1。精密吸取对照品1、2、4、8、12、16、20 μL，进样，按照“2.1“项下方法进行检测。以色谱峰面积为纵坐标，对照品盐酸多巴胺进样量（μg）为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程Y=1099.3X+0.4694（r=1），说明盐酸多巴胺在0.0107～0.2138 μg范围内与范围内峰面积呈良好线性关系。

2.6.2 精密度试验 见表2。精密吸取盐酸多巴胺对照品溶液10 μL，重复进样6次，按照“2.1”项下相应色谱条件检测，记录峰面积，结果盐酸多巴胺的峰面积RSD为0.257%，表明仪器精密度良好。

图1 对照品盐酸多巴胺液相图

表1 对照品线性关系

表2 精密度试验结果

2.6.3 稳定性试验 见表3。精密量取常温放置同一供试品溶液，分别于 0、1、2、4、8、24 h 进样，按照“2.1”项下相应色谱条件检测，记录峰面积，结果样品中盐酸多巴胺的平均质量浓度为4.92 μg/mL，RSD为0.99%，表明该供试品溶液在室温24 h内稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.6.4 重复性试验 见表4。精密称量供试品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，各6份，按照2.1项下相应色谱条件检测，记录峰面积，结果样品中盐酸多巴胺的平均含量为0.1194 mg/g，RSD 1.51%，表明该方法重复性良好。

研发投入强度(RD)：创新与制造业结构紧密相关，本文使用研发投入占GDP的比重衡量创新程度，记为RD。

表4 重复性试验结果

2.6.5 加样回收试验 见表5。精密吸取已知盐酸多巴胺含有量的供试品溶液（4.98 μg/mL）10 mL，平行 6份，置25 mL容量瓶中，分别加入对照品溶液5 mL，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，滤过，取适量续滤液按照“2.1”项下相应色谱条件检测，记录峰面积，计算加样回收率。

表5 加样回收试验结果

2.6.6 阴性干扰试验 见图2。按“2.1”项下色谱条件，测定缺附片阴性对照样品，结果阴性对照样品在盐酸多巴胺对照品相同保留位置上未见有相同保留时间的吸收峰，说明参附强心颗粒中其他组分对测定盐酸多巴胺含量无干扰。

图2 阴性样品液相图

2.7 样品含量测定

见表6。取3批样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下相应色谱条件测定，采用外标法，对3批参附强心颗粒样品进行测定，有效成分盐酸多巴胺的含量测定结果分别为 117.9、116.8 、119.2 μg/g。

表6 样品含量测定试验结果

图3 对照品液相图

3 讨 论

3.1 慢性心衰是一种严重的进行性疾病，患者的心脏泵血功能会逐渐衰退，具有发病率高，死亡率高等特点，是当今最重要的心血管疾病之一[14-16]。参附强心颗粒是本公司以古代经典名方“参附汤”为依据，在参附注射液基础上，开发的新型口服药物。为保证其临床疗效，制定稳定可控的质量标准非常必要。

3.2 采用本法测定参附强心颗粒活性成分之一盐酸多巴胺，在一定范围内呈良好的线性关系，回收率高，精密度高，无阴性干扰。

3.3 本试验考察了酸水和纯水两种溶剂，结果酸水溶剂测得盐酸多巴胺含量为117.9 μg/g，纯水溶剂测得盐酸多巴胺的含量为37.7 μg/g，酸水溶剂较纯水溶剂效果好（见图4，图5），这可能和盐酸多巴胺的结构有关：在酸性条件下呈分子状态，易于溶出（见图6）。

图4 酸水溶解样品液相图

图5 纯水溶解样品液相图

图6 盐酸多巴胺结构图

3.4 本实验考察了多种色谱系统，如：甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液等，分离效果均不理想，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液系统，分离效果较佳。

3.5 本实验建立的质量控制方法对于参附强心颗粒活性成分指标的控制提供了有益参考，为今后该产品研发的质量标准制定提供了依据。