寻常型银屑病患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达

王丽娟，万 明，安金刚

(1.中航工业西安医院 皮肤科，陕西 西安710000;2.西安市北方医院 皮肤科;3.西安交通大学第二附属医院 皮肤科)

寻常型银屑病作为一种慢性炎症性皮肤病，以皮肤瘙痒、干燥、红疹等为主要临床表现[1]，该病病因复杂，目前发生机制尚未完全清楚，且易复发[2]，给患者生活质量造成严重影响。研究表明[3]，角质形成细胞异常增殖分化、炎症细胞浸润、免疫功能异常是寻常性银屑病主要的病理基础。近年来研究发现[4]，内源性大麻素系统在皮肤正常生理代谢、炎症反应及炎症性皮肤病中发挥重要作用。大麻素受体(cannabinoid receptor，CNR)作为一种G蛋白偶联受体，包括CNR1和CNR2两个重要亚型，是内源性大麻素系统重要组成，在调控内源性大麻素系统参与的各项生理病理过程中发挥重要作用[5]。本研究为进一步探讨CNR在寻常性银屑病发病中的作用，对患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达进行分析，并探讨其在评估疾病严重程度中的意义。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床资料 选取2015年3月至2017年3月在我院皮肤科门诊就诊的寻常型银屑病患者78例，病例纳入标准：①所有患者均具有典型的临床症状，符合寻常型银屑病诊断标准[6]；②本次发病前未进行外用药物或系统治疗；③无免疫系统、结缔组织、类风湿关节炎等自身免疫性疾病；④近2月内未使用过免疫抑制剂等影响免疫功能的药物；⑤排除孕妇及哺乳期妇女。其中，男性43例，女性35例，平均年龄(31.5±6.7)岁，病程5个月-16年，平均(7.6±2.4)年，根据患者病程将患者分为静止期和进展期，其中，静止期28例，进展期50例。同期，从体检中心选取45例健康者作为血清对照组，其中，男性26例，女性19例，平均年龄(32.4±7.0)岁，两组在性别、年龄无差异(P>0.05)，均衡可比。同时，从手术室选取手术切除的正常皮肤组织40份作为皮肤对照组，均经病理学检查证实，其中，男性21例，女性19例，平均年龄(30.8±6.4)岁，与寻常型银屑病患者在性别、年龄无差异(P>0.05)，均衡可比。本研究通过医院伦理委员会批准，所有研究对象均行知情同意。

1.1.2主要试剂和设备 CNR1和CNR2检测试剂盒均购自上海研盟生物工程有限公司，Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录和PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，CNR1、CNR2及内参引物由上海生工生物公司设计合成实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清中CNR1和CNR2水平 所有寻常型银屑病患者和血清对照组均采取晨起空腹静脉血6 ml，4℃下于3 500 r/min离心20 min，留取血清，保存于-70℃以备检。利用ELISA法检测血清中CNR1和CNR2水平，所有操作均在标准实验室按照试剂盒说明完成。

1.2.2实时荧光定量PCR技术检测组织中CNR1和CNR2基因表达 取寻常型银屑病患者皮损组织和皮肤对照组正常皮肤组织，研磨后，加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒对组织中总RNA提取并检测纯度和浓度。取50 μg总RNA，逆转录为模板链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物序列：CNR1：上游：5’-GAGCAAGGACCTGAGACATGC-3’，下游：5’-CTTAACAGTGCTCTTGATGCAGC-3’；CNR2：上游：5’-GACCGCCATTGACCGATACC-3’，下游：5’-GGACCCACATGATGCCCAG-3’； GAPDH：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反应条件：94℃ 3 min，92℃ 30 s，53℃ 30 s，75℃ 30 s，连续循环38次，每个样品设3个平行反应复孔。用2-△△Ct法计算组织中CNR1和CNR2基因相对表达量。

1.2.3银屑病皮损面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)评分 寻常型银屑病患者就诊时根据皮损面积和皮损严重程度对患者进行评分[7]：公式：PASI评分=(E头+I头+D头)×A头×0.1+(E上肢+I上肢+D上肢)×A上肢×0.2+(E躯干+I躯干+D躯干)×A躯干×0.3+(E下肢+I下肢+D下肢)×A下肢×0.4。其中，A：面积，E：红斑，I：斑块肥厚程度，D：鳞屑。

1.3统计学分析

2 结果

2.1寻常型银屑病患者和血清对照组血清中CNR1和CNR2水平比较

寻常型银屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 寻常型银屑病患者和血清对照组血清中CNR1和CNR2水平比较

2.2不同病程寻常型银屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比较

与血清对照组相比，进展期和静止期寻常型银屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均升高，且进展期高于静止期，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同病程寻常型银屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比较

注：与血清对照组相比，aP<0.05；与静止期相比，bP<0.05

2.3寻常型银屑病患者和皮肤对照组皮肤组织中CNR1和CNR2表达比较

寻常型银屑病患者皮损组织中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相对表达量均高于皮肤对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 寻常型银屑病患者和血清对照组血清中CNR1和CNR2水平比较

2.4不同病程寻常型银屑病患者皮损组织中CNR1和CNR2表达比较

与皮肤对照组相比，进展期和静止期寻常型银屑病患者皮损组织中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相对表达量均升高，且进展期高于静止期，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同病程寻常型银屑病患者皮损组织中CNR1和CNR2表达比较

注：与皮肤对照组相比，aP<0.05；与静止期相比，bP<0.05

2.5寻常型银屑病患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达与PASI评分相关性

Pearson相关分析显示，寻常型银屑病患者血清CNR1和CNR2水平均与PASI评分呈正相关(r=0.412、0.435，P<0.05)，皮损组织中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相对表达量均与PASI评分呈正相关(r=0.324、0.406，P<0.05)。

3 讨论

银屑病是常见的皮肤慢性炎症性疾病，与免疫系统功能异常密切相关，且病程迁延反复、尚无特效的治愈方法[8]，寻常型银屑病是银屑病中最常见类型，约占银屑病的90%以上[9]，由于该病病因及机制尚未完全清楚，已成为临床研究重点。近年来，内源性大麻素系统在疾病发生及治疗中的作用越来越受到重视，研究发现[10]，内源性大麻素系统在应激、疼痛、免疫、认知、运动、肿瘤等多种肿瘤生理过程中发挥重要作用。同时，在维持皮肤稳态及调控细胞增殖、分化、凋亡中起重要作用[11]。CNR作为内源性大麻素系统中关键性组成部分，在其功能发挥中发挥核心作用[12]，包括CNR1和CNR2两种主要的类型，CNR1主要存在于中枢神经系统，近年来发现，脾脏、皮肤、免疫细胞等外周器官及组织中也分布广泛[13]，CNR2主要分布在脾脏、扁桃体等外周器官，在免疫调节中发挥重要作用[14]。陶科明等[15]指出，CNR1和CNR2在溃疡性结肠炎中表达上调，可能参与了其发生发展过程。本研究为进一步探讨CNR在寻常型银屑病发生中的作用，对患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达进行了分析。

本研究结果显示，寻常型银屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清对照组，且皮损组织中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相对表达量均高于皮肤对照组，说明CNR1和CNR2在寻常型银屑病患者血清和皮损组织中表达水平升高，提示CNR1和CNR2可能参与了寻常型银屑病发病过程。本研究结果显示，与血清对照组和皮肤对照组相比，进展期和静止期寻常型银屑病患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达水平均升高，且进展期高于静止期，说明CNR1和CNR2可能与寻常型银屑病患者病情严重程度有关，随着寻常型银屑病病情活跃程度增加，CNR1和CNR2表达量增加，提示CNR1和CNR2有望成为监测患者病情的指标。同时，本研究相关分析亦显示，患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2水平均与PASI评分呈正相关，而PASI是反映银屑病严重程度的指标[16]，进一步说明CNR1和CNR2可能参与了患者病情进展过程。

综上所述，寻常型银屑病患者血清和皮损组织中CNR1和CNR2表达升高，且与患者病情严重程度有关，可能参与了患者病情进展过程，有望为寻常型银屑病机制研究及临床治疗提供新的方向和靶位。

作者简介：安金刚(1978-)，男，山东人，博士，副研究员，主要研究方向为特应性皮炎，银屑病。