36个葡萄品种遗传多样性ISSR分析

吴代东，陈立*，李洪艳，吴艳艳，周咏梅，夏周祥，谢太理

（1. 广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，南宁 530007；2. 广西大学植物科学国家级实验教学示范中心，南宁530004；3. 广西农业科学院生物技术研究所，南宁 530007；4. 广西大学生命科学院，南宁 530004）

近～4年来，关于植物遗传关系的ISSR分析的研究不断增加，有关葡萄种质资源丰富的遗传多样性，已经可以利用ISSR分子标记有效地揭示刺葡萄种质资源的遗传多样性和亲缘关系[1-2]。此外，目前已建立和优化稳定的葡萄ISSR-PCR反应体系[3-5]，为进一步开展野生葡萄遗传多样性研究和品种选优提供理论依据。不同品种的葡萄在表型上不易区分，但是在遗传性质上的差异则非常明显，它们的基因不同，而遗传物质的差异可以通过提取DNA进行电泳加以区分。葡萄在农业生产上，不同品种抗逆性有显著差别，特别是野生种质在抗病性、功能性成分和逆境胁迫方面与栽培品种有显著不同。其品种繁多、来源复杂，不便于区分，本研究对36份葡萄材料进行DNA提取，探究了葡萄的遗传多样性，并且构建不同种之间的遗传关系图谱。通过分析葡萄遗传关系来更方便地区分不同品种，对于葡萄产业的发展特别是种质资源创新利用，杂交后代的亲缘关系分析和鉴定来说，具有一定的经济价值效益。

1 材料与方法

1.1 材料

用于ISSR分析的材料共36份，分别为：‘水源2号’‘水源14号’‘水源5号’等见表1。研究材料取自广西农业科学院葡萄研究团队的资源圃，试验在广西大学植物科学国家级实验教学示范中心实验室进行。

1.2 试验方法

利用生工生物工程（上海）股份有限公司生产的Ezup柱式植物基因DNA抽提试剂盒，从选择的所有葡萄材料幼叶中提取基因组DNA，于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，通过Eppendorf公司生产的Bio-Photometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度，并将浓度稀释至20 ng/μL。PCR扩增采用10 μL反应体系，其中含6 μL 2×Taq PCR Master Mix, 1 μL ISSR引物，1 μL（20 ng）DNA模板，2 μL ddH2O。用于ISSR-PCR反应的6 μL 2×Taq PCR Master Mix、标准分子量（Marker）、引物根据哥伦比亚大学公布序列设计[6-8]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR反应在美国MJ公司的PTC-200型PCR循环仪上进行。扩增产物经含有4 μg/mL GelRed核酸染料的10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，于Gene Genius公司的Bio Imaging System凝胶成像系统上记录数据。

根据各引物标记的迁移率及其有无统计所有的矩阵数据，有带记作1，无带记为0，强带和弱带均赋值。利用popgene 32软件对6对引物扩增的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon多样性指数（I）及多态性位点百分比等进行计算；利用NTSYSpc Version 2.10e软件计算成对种质间Jaccord（J）遗传相似系数，并根据遗传相似系数，分析通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，建立亲缘关系图。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

由葡萄的总DNA提取后进行电泳得到其电泳图谱，各葡萄材料与其编号关系（表1），M表示Takara公司100bp DNA ladder Marker，电泳条带清晰。从100条引物中筛选出两条多态性非常丰富的用于ISSR分析的ISSR引物，分别为33F（ISSR810）、37F（ISSR820），序列编号（表2）。36份葡萄材料用33F号引物扩增，一共扩增出208条DNA条带，扩增的条带大小介于200～3000 bp，以400～1500 bp的带条居多，平均每份材料扩增条带约为8条，多态性百分率高达83%，多态性丰富。其中只有‘水源5号’‘刺水14’‘水源16号’‘桂葡3号’4种葡萄材料的扩增片段较少，其余的都非常丰富，可见该引物确实适合于葡萄遗传多样性的ISSR分析（图1）。

表1 33F 扩增葡萄材料及其编号Table 1 33F amplification of grape materials and their numbers

表2 引物编号及序列Table 2 Primer numbers and sequence

另外，还进行了同时以37F为引物对材料进行ISSR扩增，一共扩增出151条电泳条带，这些条带同样介于200～3000 bp，平均条带约为11条，多态性百分率约为79%（图2）。

将二元矩阵数据导入popgene得到36份葡萄平均有效等位基因数（Ne）为1.3894，平均Nei's基因多样性指数为0.2342，平均Shannon's信息指数为0.3529。各位点遗传多样性程度存在差异，Nei's基因多样性指数最大值为0.4985，最小值为0.1049。Shannon's信息指数最大值为0.6916，最小值为0.2146。多态性位点数为24，所有引物的多态性条带比例均为66.7%，表明所选引物遗传多态性高，进而表明了不同葡萄品种之间的遗传差异。

2.2 聚类分析

由2对ISSR引物的扩增结果，利用NTSYSpc Version2.10e软件，根据各品种之间的相似系数，通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析[6-7]，建立亲缘关系（图3），我们发现在这36份品种中的遗传相似系数在0.36～0.92，在相似度0.36处可以分为两大类。

第一类包含9个品种分别为：‘雷司令’‘刺水14’‘黑珍珠4号’‘桂葡3号’‘水源13号’‘水源14号’‘摩尔多瓦’‘水源5号’‘水源11号’；

第二类包含27个品种，在相似度0.624处又可分为3组：第1组包括‘水源12号’‘水源4号’‘金1’‘金2’‘水源3号’‘桂葡6号’‘水源8号’‘水源1号’‘野酿2号’‘水源9号’‘水源7号’‘水源6号’‘水源2号’‘金3’‘水源16号’‘圆叶葡萄-弗雷尔’；第2组包括‘赤霞珠’‘马瑟兰’‘凌丰’‘媚丽’‘水晶’‘爱格丽’‘品丽珠’‘美乐’‘霞多丽’‘西拉’；第3组包括‘黑珍珠4-1号’。

3 讨论与结论

ISSR标记是葡萄种质资源鉴定的有效方法，本文以36个品种为研究对象，利用2对ISSR引物对上述品种进行扩增并进行多态性分析，33F（ISSR810）、37F（ISSR820）两条引物的多态性较好，其中经ISSR820 PCR扩增得到DNA片段条带最多，比率高达83%。

图1 33F序列下1-36号葡萄材料扩增电泳图谱Figure 1 1-36 expansion electrophoresis of grape materials in the sequence of 33F

图2 37F序列下1-36号葡萄材料扩增电泳图谱Figure 2 1-36 expansion electrophoresis of grape materials in the sequence of 37F

图3 根据 ISSR 结果构建的 36 份葡萄材料亲缘关系树状图Figure 3 Dendrogram of 36 grape cultivars based on ISSR markers

从用途来看，除‘水晶’‘凌丰’及‘圆叶葡萄-弗雷尔’可做鲜食和酿酒两用外，大部分材料都是酿酒葡萄，这可能与性状连锁有关[7]。‘黑珍珠4-1号’是‘黑珍珠4号’杂交品种，因而遗传相似度相差较大。本研究选择材料‘野酿2号’‘圆叶葡萄-弗雷尔’‘刺水14’‘水晶’都是白腐病高抗品种[8]，而‘凌丰’‘雷司令’‘摩尔多瓦’对白腐病抗性表现一般。即本文研究的ISSR位点可能与某些决定葡萄叶片及果实抗病性的基因连锁，酿酒葡萄与野生毛葡萄由于叶片气孔大小、果皮厚度含量等性状的不同，可以被区分开来[9-10]，如邹瑜等2014年利用SSR分析70份毛葡萄遗传多样性[11]。方辉等2017年利用毛葡萄叶片高通量转录组测序数据进行简单重复序列搜索并注释[12]。本试验中可能也是利用调控某些抗病性状的基因与ISSR位点连锁，从而将高抗品种与感病品种区分开，这有待于进一步的研究。

通过聚类分析基本上可以从毛葡萄抗性方面实现对各种质的区分，并可以有效的分析各种质之间的亲缘关系。本研究从分子水平上为葡萄种质资源的鉴别、遗传多样性和亲缘关系分析提供了参考价值。