烟台产区三个红色酿酒葡萄品种花色苷的对比研究

王安妮，宋英辉，唐美玲，肖慧琳，郑秋玲，王婷，张超杰*，王咏梅

（1. 山东省烟台市农业科学研究院，山东烟台 265500；2. 蓬莱市葡萄与葡萄酒技术研究推广中心， 山东蓬莱 265600；3. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100）

花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的，呈现红色、紫色或者蓝色的一类酚类化合物[1]，对葡萄果实和葡萄酒颜色至关重要。葡萄果实中花色苷的组分和含量受气候、土壤和栽培方式等因素影响[2-5]，但主要还是由遗传物质决定，与基因结构密切相关[6-7]。

花色苷是含有C6-C3-C6骨架的类黄酮类物质[8]，由于B环上的取代基的位置和数量不同演变出了不同类型的花色苷，主要分为6类：花青素类（Cyanindin，Cy）、花葵素类（Pelargonidin，Pg）、花翠素类（Delphinidin，Dp）、甲基花青素类（Peonidin，Pn）、甲基花翠素类（Petunidin，Pt）和二甲花翠素类（Malvidin，Mv）。葡萄果皮中二甲花翠素类含量最高，而花葵素类含量极少，较不常见[9]。同时根据结构又可分基本花色苷（非酰化花色苷）和酰化花色苷[10]。酰化花色苷较稳定，在酿酒葡萄果实及葡萄酒中起到积极作用。

烟台产区原来主栽的红色品种为‘赤霞珠’，但由于‘赤霞珠’抗性较差，近年来引进了‘马瑟兰’和‘小味儿多’新型品种，其栽培面积逐年扩大，逐渐成为主栽品种。‘马瑟兰’是‘赤霞珠’和‘歌海娜’的杂交品种，继承了‘赤霞珠’的细致感和‘歌海娜’的耐热性[11]；‘小味儿多’果皮厚且色泽深沉，有研究表明蓬莱地区‘小味儿多’花色苷总量高于‘赤霞珠’[12]。花色苷是判断葡萄酒品质好坏的重要指标[13-14]，不同酿酒葡萄品种之间花色苷的存在形式和所占比例有一定的差异。为进一步丰富烟台产区酿酒葡萄栽培品种，本文采用HPLC法对3个品种花色苷的组成和含量进行测定，分析花色苷的品种特性，为提高葡萄酒品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3个酿酒品种均采自于蓬莱龙湖酒庄。葡萄园土壤为棕壤土，肥力中等，排水良好。属于暖温带海洋季风气候，年平均气温12.8 ℃，年日照时数2511.4 h，年平均降雨量为683.9 mm。3个品种树龄均为4年，南北行向，株行距1 m×2 m，单干单臂＋直立叶幕整形。果实成熟时每个处理随机取样100粒浆果，放入冰盒带回实验室剥取果皮放入液氮中速冻，然后用研钵磨成粉末放入真空冷冻干燥机-40 ℃下冷冻干燥24 h，果皮粉保存在-40 ℃冰箱内备用。

花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷标准品：Miragen公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（分析纯）：海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 Inf i nity高效液相色谱仪：德国waldbronn公司；电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；有机相过滤器：安捷伦科技有限公司；超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；IKA MS3 basic涡旋振荡器：艾卡仪器设备有限公司；Centrifuge 5430R高速离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Intertsil ODS-3 Column色谱柱：250 mm×4.6 mm×5µm；流速：1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 µL；检测波长：525 nm；流动相A，甲酸∶水＝1∶9，流动相B，甲酸∶乙腈＝1∶9（梯度洗脱见表1）。

1.3.2 果皮花色苷的提取

准确称重果皮粉0.2 g放入研钵，加入1.5 mL的提取液（甲酸∶水∶甲醇＝2∶28∶70）继续研磨至无明显颗粒状，并用移液枪吸取1 mL于离心管中。室温下1500 r/min避光摇床震荡10 min，然后4 ℃下13 000 r/min低温离心10 min，取上清液经0.22 µm的滤膜过滤并收集到离心管内。-80 ℃保存待测上机。

1.3.3 花色苷定性定量分析

采用花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷五种标准品对葡萄果皮中的基本花色苷进行定量。其它各类酰化的花色苷参考梁振昌测定结果推断色谱峰代表成分[15]。

1.4 数据处理

表1 梯度洗脱条件和程序Table 1 Gradient elution conditions and procedures

采用IBM SPSS statistics 22软件的单因素分析对实验数据进行显著性分析，显著性水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

分别精确称取5种标准品1 mg，用10%的甲酸溶液配制成质量浓度为10、20、50、100、200 mg/L的标准溶液，经0.22 µm滤膜过滤后，在确定的色谱条件下上机测定，拟合5种花色苷的质量浓度（y）和峰面积（x），得到标准曲线方程进行定量分析。二甲花翠素3-O-葡萄糖苷标准样品的线性方程：y＝0.0154x－2.4549，R2＝0.9992；花翠素-3-O-葡萄糖苷标准样品的线性方程：y＝0.0274x＋1.5545，R2＝0.9994；甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷标准样品的线性方程：y＝0.015x＋2.401，R2＝0.9996；花青素-3-O-葡萄糖苷标准样品的线性方程：y＝0.0174x＋0.3053，R2＝0.9995；甲基花青素-3-O-葡萄糖苷标准样品的线性方程：y＝0.0164x＋3.0154，R2＝0.9993。R2均在0.9992以上，线性关系良好，符合高效液相色谱的标准。

2.2 花色苷组分分析

如表2、表3所示，3种红色酿酒品种共检测到15种花色苷，包括5大类花色苷，其中花青素类2种，花翠素类3种，甲基花青素类3种，甲基花翠素类3种，二甲基类花翠素4种。‘小味儿多’和‘赤霞珠’均检测出14种，而‘马瑟兰’只检测出12种。其中花翠素-3-O葡萄糖苷-乙酸酯是‘赤霞珠’特有的组分；‘马瑟兰’缺少花青素-3-O葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷-乙酸酯这两种组分。

3个品种都检测出2种双葡萄糖苷，分别是甲基花青素-3-O-葡糖苷-5-O-葡萄糖苷-咖啡酸酯和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷-咖啡酸酯，其它的都是单葡萄糖苷。大多研究结果表明，双葡萄糖苷花色苷仅存在于欧美种中，是其重要的显色特征物质，而欧亚种葡萄中只含有单葡萄糖苷花色苷。但近年来也有少数研究表明，一些欧亚种中也存在少量双糖苷[16]。

3个品种都检测到3种酰化的花色苷，分别是香豆酰化、乙酰化和咖啡酰化。‘马瑟兰’酰化花色苷相对含量较高为56.39%，且多以香豆酰化的形式存在。而‘小味儿多’和‘赤霞珠’未酰化花色苷比例高，约占50%以上，且酰化花色苷多以乙酰化花色苷形式存在。3个酿酒葡萄品种的咖啡酰化花色苷的相对含量最低，均不到5%。

由表4所示，14种花色苷组分相对含量最高的均是二甲花翠素类，这与多个研究结果一致[17-19]。其中‘马瑟兰’的二甲基花翠素类的相对含量高达90%以上；‘小味儿多’‘赤霞珠’相对含量为80%左右；其次是甲基花青素类花色苷3个品种均在10%以下。‘马瑟兰’的花翠素类相对含量较低于甲基花翠素类，而‘赤霞珠’和‘小味儿多’与之相反。含量最低的是花青素类，‘赤霞珠’和‘马瑟兰’中相对质量还不足1%。

3个酿酒葡萄品种相对含量最高的均为二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中‘小味儿多’的相对含量最高为42.21%，其次是‘赤霞珠’为40.99%，而‘马瑟兰’占37.94%。三个酿酒葡萄品种中，‘马瑟兰’的花色苷组成较其他两个品种差别较大。主要体现在酰化花色苷的表达。‘马瑟兰’酰化花色苷主要以二甲花翠素的香豆酰化形式存在，占整体花色苷的34.82%，而二甲花翠素的酰化花色苷占17.04%。‘赤霞珠’和‘小味儿多’相对含量组成相差不大，酰化花色苷主要以二甲花翠素的乙酰化为主，分别占26.26%和24.54%。相比于‘马瑟兰’而言，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-对香豆酸的相对含量较低，分别为11.64%和11.77%。除却三个相对含量较高的花色苷，其余花色苷的相对百分含量均在7%以下，且不同品种之间占比不同。

表2 三个酿酒葡萄品种葡萄皮中花色苷数量 （单位：种）Table 2 Number of anthocyanins in grape skins from three wine grape varieties (Unit: types)

表3 三个酿酒葡萄品种酰化类花色苷相对含量 （单位：%）Table 3 The relative content of acylated anthocyanins in three wine grape varieties（Unit: %）

2.3 五种基本花色苷含量对比分析

由表5可知，三个酿酒葡萄品种中5种基本花色苷含量高低顺序不尽相同，但含量最高的均是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中‘小味儿多’为1155.5 mg/kg，‘马瑟兰’为1064.86 mg/kg，‘赤霞珠’最低为699.06 mg/kg。除了二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷，‘马瑟兰’的其余四种基本花色苷含量均为最低。不仅如此，‘马瑟兰’中并未检测到花青素-3-O-葡萄糖苷，而其他两个品种中该花色苷含量也是最低。其中‘小味儿多’含量最高也仅为24.03 mg/kg，而‘赤霞珠’为16.85 mg/kg。总体可以看出，基本花色苷总量顺序为：小味儿多＞马瑟兰＞赤霞珠。

3 讨论与结论

表4 三个酿酒葡萄品种葡萄皮花色苷相对百分含量 （单位：%）Table 4 Relative percentages of anthocyanins in grape skins of three wine grape varieties (Unit: %)

表5 三种酿酒葡萄中5种基本花色苷含量 （单位：mg/kg）Table 5 Five basic anthocyanins in three wine grapes (Unit: mg/kg)

本次试验利用高效液相色谱（HPLC）法对烟台产区同一基地的三个酿酒葡萄品种花色苷进行分离测定，探究了不同品种间花色苷组成及含量的差异。其中共检测到15种花色苷组分，三个品种花色苷单体数量不尽相同。‘马瑟兰’的香豆酰化花色苷含量高，而‘赤霞珠’和‘小味儿多’乙酰化花色苷含量高。三个品种花色苷五种基本花色苷总量排列顺序为小味儿多＞马瑟兰＞赤霞珠，均以二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最高，占花色苷总量的30%以上。

烟台地区与甘肃及山西地区相比[17,20]，烟台地区酿酒葡萄的酰化类花色苷所占比例较高，稳定性更好。但花色苷的含量偏低，这可能与树龄和气候有较大关系，七八月份气温偏高，温差较小，前期旱中间涝后期旱，导致根系新梢长势较差，影响了花色苷的积累，而具体原因需进一步考究。