水仙属DNA条形码鉴定技术

张程飞, 于文涛, 李 敏, 张 慧, 邢冬昊, 陈清西, 沈建国(.福建农林大学园艺学院，福建 福州 35000；.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建 福州 35000)

水仙属(NarcissusL.)属石蒜科(Amaryllidaceae)，约60余种，多数为多年生鳞球茎观赏植物，我国有2种1变种[1].其中，黄水仙(NarcissuspseudonarcissusL.)起源于地中海沿岸，包括40多个原生品种，为世界著名鳞球茎花卉[2-3].近年来，黄水仙等进境鳞球茎花卉的数量和贸易额一直呈增长趋势.这些进境鳞球茎花卉在进境时并未进行物种鉴定，且通过肉眼观察和常规显微镜观察也难以对其开展快速精确鉴定.因此，为保护和促进我国花卉产业发展，非常有必要开展黄水仙等进境鳞球茎花卉的多目标精确鉴定技术研究.

相对于传统分类学中的形态学鉴定而言，近年来分子生物学蓬勃发展，大量物种的DNA序列被共享到基因库，使得依据物种基因序列的分子鉴定成为可能.尤其是2003年Hebert et al提出DNA条形码以来，该技术发展迅速，他提出DNA条形码的定义：运用短的标准的DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定[4-5].长期以来，对于植物DNA条形码的选取多在叶绿体片段上，如matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、rpoB和nhdJ等基因、片段及其不同组合[6].最近几年，植物的DNA条形码研究主要集中在叶绿体基因组和核基因组，包括非编码区和编码区[7]，叶绿体基因、片段包括matK基因、rbcL基因、trnH-psbA片段和核基因片段ITS，广泛应用于鉴定高等植物类群的研究中[6,8-11].

在水仙属的分子生物学研究方面，Santos-Gally et al[2]研究认为，水仙属植物多样性的形成过程与地中海沿岸的地质历史活动、地中海气候的形成相关；Ito et al[12]基于matK基因序列的分子系统学研究将水仙属置于石蒜科中的地中海分支.这些研究多着眼于植物系统学和生物地理学等方面的研究，而DNA条形码技术在水仙属中的应用有待研究.本试验选取4个候选DNA条形码，对引进自荷兰的黄水仙、多花水仙，结合中国水仙，进行DNA条形码通用性和鉴定分辨率等研究，旨在为进境黄水仙、多花水仙等水仙属花卉的快速鉴定技术提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为8个黄水仙品种、1个多花水仙品种和1个中国水仙对比品种(表1).其中，黄水仙和多花水仙品种于2015年自荷兰引进；中国水仙选取漳州水仙作为对比进行试验.

表1 供试水仙品种名称Table 1 The tested Narcissus cultivars

各品种供试材料均选取周径为15～20 cm、球体饱满、外表无伤痕的健康种球，每个品种选取3个个体，共计30份样品.

1.2 方法

1.2.1 引物的选取 本试验使用的4组备选DNA条形码由国际生命条形码联盟植物工作组推荐[6,11]，使用的通用引物序列见表2.

表2 PCR反应引物的序列Table 2 Primer sequences for PCR amplification

1.2.2 植物DNA的提取 黄水仙及其外类群选取新鲜植物的叶片部分，每份样品称取60 mg，使用植物基因组DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取.

1.2.3 PCR反应体系和反应程序 扩增反应总体积为25 μL：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)、引物(原始引物浓度10 pmol·μL-1)各1 μL、3 μL 50～200 ng·μL-1DNA模板、7.5 μL dd H2O.

matK反应程序为：94 ℃ 3 min，(94℃ 30 s，41 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min) (35、72 ℃ 10 min)；rbcL反应程序为：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，48 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min)；trnH-psbA反应程序为：94 ℃ 3 min；(94 ℃ 30 s，47 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min)；ITS反应程序为：94 ℃ 3 min，(94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)(35、72 ℃ 10 min).

取10 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶和1×TAE缓冲液中电泳，核酸染料染色后用凝胶成像系统拍照.扩增产物测序委托上海生物工程公司完成.

1.2.4 数据分析 序列信息编辑采用Sequencher 4.1.4软件完成.采用MEGA 5.0软件统计不同序列的长度、碱基含量和简约信息位点.采用TaxonDNA软件进行条形码间隔分析.采用MEGA 5.0软件构建邻接树，分析候选条形码的鉴定分辨率.

2 结果与分析

2.1 PCR扩增效率和测序成功率

表3 引物扩增效率和测序成功率Table 3 The success rate of primer amplification and sequencing

在前期工作中，除选取matK、rbcL、trnH-psbA和ITS 4对国际生命条形码联盟植物工作组推荐使用的引物外，还选取了psbH-petB、trnL-trnF、trnG-trnS、rpoB、rpoC1和ITS2 6对引物进行PCR扩增，由于这些片段的扩增效率和测序成功率较低，最终确定使用国际生命条形码联盟植物工作组推荐的4对引物.从表3可见：除ITS外，其他3组序列的扩增效率均为100%；从测序结果看，matK和rbcL的测序成功率均为100%，而trnH-psbA和ITS部分样品存在重叠峰和poly结构，对鉴定结果有一定的影响.

2.2 不同序列的特征

采用MEGA 5.0软件对4条序列矩阵进行分析，结果(表4)表明：4个候选的DNA条形码中，核基因片段ITS简约信息位点最多，占8.97%；叶绿体基因组的matK、rbcL和trnH-psbA片段中，matK序列简约信息位点有23个简约信息位点，占序列全长的2.50%；但rbcL和trnH-psbA片段的PCR扩增产物中仅含有6个简约信息位点，比率为1%左右，表明这两条DNA片段在水仙属中相对保守.

表4 4个候选条形码的基本信息Table 4 The basic information of 4 DNA barcode candidates

2.3 建树法的分辨率

2.3.1 4个单独候选条形码构建的邻接树 采用建树法构建邻接树，对每个品种进行鉴定分析.建树法鉴定是查看同属于一个物种(品种)的不同个体是否聚于一支，若能且没有其他物种(品种)则说明能够准确鉴定该物种(品种)，反之则不能准确鉴定[11].从matK序列构建的邻接树(图1)可以看出：塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美8个品种聚于同一支，支持率达到100%；荷兰船长、迪克威尔顿和舒雅 3个品种聚于同一支，支持率为65%；粉魅力和莎乐美聚于同一支，支持率为63%；而新娘皇冠和中国水仙聚于同一支，支持率为100%.总体上说，matK条形码序列具备识别国外9种水仙的能力，且能鉴定出部分品种间的亲缘关系，但中国水仙嵌入黄水仙的分支中.

从trnH-psbA序列构建的邻接树(图2)可以看出：塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美8个品种聚于同一支，支持率为87%；塔希提、冰花和拉斯维加斯3个品种聚于同一支，支持率为66%；粉魅力和莎乐美2个品种聚于同一支，支持率为86%；新娘皇冠和中国水仙聚于同一支，支持率为64%.该条形码序列具备识别国外9种水仙的能力，且能鉴定出部分品种间的亲缘关系，但不能识别出中国水仙和国外水仙.

图1 基于matK条形码构建的邻接树Fig.1 The neighbour-joining tree of matK barcode图2 基于trnH-psbA条形码构建的邻接树Fig.2 The neighbour-joining tree of trnH-psbA barcode

从rbcL序列构建的邻接树(图3)可以看出： 塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美8个品种聚于同一支，支持率达到99%；新娘皇冠和中国水仙聚于同一支，支持率为60%.从鉴定结果可以看出，rbcL条形码片段相对其他片段较为保守，具备识别国外9种水仙的能力，但不能鉴定出部分品种间的亲缘关系，也不能识别出中国水仙和国外水仙，可作为辅助条形码运用于水仙属的物种鉴定.

从ITS序列构建的邻接树(图4)可以看出：塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、新娘皇冠、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美9个品种聚于同一支，支持率达到100%；中国水仙单聚一支，支持率为99%.作为核基因片段的ITS序列简约信息位点较多，可以准确鉴定出中国水仙和国外水仙，但在鉴定国外水仙品种间的亲缘关系时支持率较低且鉴定出的亲缘关系较乱.因此可将ITS条形码片段作为辅助条形码进行水仙属的种间鉴定.

2.3.2matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码构建的邻接树matK、trnH-psbA和rbcL序列均为叶绿体基因片段，将3个片段组合，从组合序列构建的邻接树(图5)可以看出：塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美8个品种聚于同一支，支持率为100%；荷兰船长、迪克威尔顿和舒雅 3个品种聚于同一支，支持率为63%；粉魅力和莎乐美2个品种聚于同一支，支持率为92%；塔希提、冰花和拉斯维加斯3个品种聚于同一支，支持率为60%；新娘皇冠和中国水仙聚于同一支，支持率为100%.该组合条形码具备鉴定国外9种水仙的能力，且能识别出品种间的亲缘关系，但不能准确鉴定出国外水仙和中国水仙.

图3 基于rbcL条形码构建的邻接树Fig.3 The neighbour-joining tree of rbcL barcode图4 基于ITS条形码构建的邻接树Fig.4 The neighbour-joining tree of ITS barcode

图5 基于matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码构建的邻接树Fig.5 The neighbour-joining tree of matK+trnH-psbA+rbcL combination barcode

2.3.3 ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码构建的邻接树 将ITS、matK、trnH-psbA和rbcL4条序列片段组合，构建邻接树.从构建的邻接树(图6)可以看出：塔希提、荷兰船长、冰花、粉魅力、拉斯维加斯、迪克威尔顿、舒雅和莎乐美8个品种聚于同一支，支持率为100%；荷兰船长、迪克威尔顿和舒雅 3个品种聚于同一支，支持率为55%；粉魅力和莎乐美 2个品种聚于同一支，支持率为83%；塔希提、冰花和拉斯维加斯 3个品种聚于同一支，支持率为42%；新娘皇冠单聚一支，支持率为100%；中国水仙单聚一支，支持率为100%；新娘皇冠与中国水仙具有一定的亲缘关系.该组合条形码具备鉴定出中国水仙和国外水仙的能力，能识别出国外水仙品种间的亲缘关系，且可以识别出中国水仙与国外水仙的亲缘关系.

2.4 距离法的分辨率

条形码间隔是检验候选条形码是否能作为该物种DNA条形码的一个重要判断，间隔的形成需要同属内种间遗传距离明显大于种内遗传距离，且二者之间的差异具有显著性[13].采用TaxonDNA软件对序列矩阵进行计算分析，得出各候选条形码及其组合条形码的种内和种间遗传距离(表5)，进而做出各个序列及其组合的条形码间隔直方图(图7).从图7可以看出，各条形码及其片段组合均存在明显的条形码间隔.其中，ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码在0.5%～3.0%有部分重叠，其他条形码或组合基本不存在种内遗传距离和种间遗传距离的重叠.单个ITS序列在0.0%～1.5%的种内遗传距离大于种间遗传距离.

图6 基于ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码构建的邻接树Fig.6 The neighbor-joining tree of ITS+matK+trnH+psbA+rbcL combination barcode

表5 4个条形码序列及其组合的距离法分辨率Table 5 The resolution of distance method of 4 sequences and combination

图7 候选条形码的间隔分布Fig.7 The distribution of DNA barcoding gap of candidate barcode

在Best Match和Best Close Match模式下，物种种间遗传距离较大的条形码的分辨率越高；而All Species Barcode模式则要求物种种间遗传距离较大的同时，种内遗传距离要足够小才能得到较高的分辨率[14].从表5可以看出，matK、trnH-psbA、rbcL、matK+trnH-psbA、matK+rbcL、trnH-psbA+rbcL和matK+trnH-psbA+rbcL条形码序列或组合条形码的Best Match和Best Close Match均为80.00%，且matK、trnH-psbA和rbcL3条序列均为叶绿体片段.ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码的Best Match和Best Close Match均为100%，这几条组合条形码都包括了核基因的ITS片段，就单个ITS片段而言，Best Match和Best Close Match分别为80.00%和76.67%.在All Species Barcode模式下，ITS+matK、ITS+trnH-psbA和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码的分辨率均为100%，但单个ITS片段的分辨率却仅有10.00%，其他序列或组合条形码的分辨率均在80.00%以上.

3 讨论

DNA条形码技术是运用一种短的DNA片段对物种进行快速的识别和鉴定，是一种新兴的分子生物学技术，目前已在动物类群中得到充分的研究和运用，但在植物类群中仍处于寻找合适的基因片段阶段，在水仙属中尚未见研究报道.DNA条形码相对于其他鉴定方法有许多优点，以DNA序列作为检测对象，在其个体发育过程中不会发生变化，且不用过度依赖形态学专家的鉴定经验，且准确度较高，鉴定结果可以存入相应的数据库，二次鉴定可以快速鉴定大量的样本.

3.1 引物的通用性

通用性是判断DNA条形码是否理想的最重要标准之一.在3个叶绿体片段中，rbcL和matK的通用性最高，测序成功率均达到100.00%，trnH-psbA的通用性次之，这与Peter et al[6]和Group et al[11]的研究结果一致.

在核基因方面，本试验中的ITS片段的通用性高于它在目前已研究的被子植物中的通用性，但在4个候选条形码中其通用性仍然是最低的，这一结论与其他类群的研究结果[11]一致.本试验的ITS候选条形码测序结果中未发现多拷贝序列及真菌污染.由于核基因区域进化速率快，故可能获得较高的鉴定分辨率[15-16]，核基因中的ITS片段曾被推荐为植物潜在的核心DNA条形码[6,15]；然而，由于它的多拷贝区域的不一致性进化引起了杂交和基因渐渗等现象[17]，从而导致在一些类群中其扩增和测序成功率较低，以及在PCR扩增中存在真菌污染等问题，导致其没有成为首批的生命条形码联盟(COBL)植物核心条形码.最近的研究结果[11]显示，核基因中的ITS片段在被子植物中具有约80%的测序成功率，且具有多拷贝和真菌污染等问题也是少数类群，此结果与本试验结果相同.因此，本试验支持将ITS列为植物的候选核心条形码的观点.

3.2 候选DNA条形码的鉴定分辨率

本试验结果表明，4种条形码片段单独运用均具有一定的鉴定水仙属物种间的能力，3个叶绿体基因片段可将黄水仙与其他物种分开，但不能区分中国水仙与多花水仙，原因可能是中国水仙是多花水仙的一个变种，叶绿体基因片段鉴别能力有限；核基因片段ITS序列具有较多的简约信息位点，可以准确鉴定出中国水仙和多花水仙，但在鉴定国外水仙品种间的亲缘关系时支持率较低.将4种基因片段组合起来具有较强的鉴定能力，能准确鉴定出中国水仙和国外水仙，也能识别出国外水仙品种间的亲缘关系，且可以识别出中国水仙与国外水仙具有一定的亲缘关系.

在对候选条形码序列及其组合条形码进行分析的结果表明，4个候选条形码及其组合条形码均具有条形码间隔，在一定程度上说明4条DNA片段可以作为水仙属鉴定的条形码.在Best Match和Best Close Match模式下对比序列及其组合对水仙属鉴定的能力，分辨率最高的是ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码，均为100%，ITS的Best Close Match分辨率为76.67%，其他均为80.00%.在All Species Barcode模式下，ITS+matK、ITS+trnH-psbA和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL组合条形码的分辨率最高，均为100%，但单个ITS片段的分辨率较低，可能与其进化速率较快，种内遗传距离较大有关，其他候选条形码或组合条形码的分辨率均在80.00%以上.从距离分析法的角度上看，ITS+matK、ITS+trnH-psbA、ITS+rbcL和ITS+matK+trnH-psbA+rbcL4条组合条形码适合用于水仙属的物种鉴定，从易用性上看，ITS+matK可作为推荐组合条形码.

综上，经过与形态学鉴定结果的比对，DNA条形码技术适用于水仙属的物种鉴定，本类群的推荐DNA条形码为ITS+matK.由于水仙属的植物多为园艺栽培植物，品种众多，每个品种的精确鉴定技术有待于进一步研究.