不同年份高良姜挥发油成分分析及其指纹图谱

袁 源，林丽静，黄晓兵*，彭芍丹，李积华

（中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东 湛江 524001）

高良姜，别名高凉姜、良姜、蛮姜和佛手根等，为姜科山姜属多年生草本植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的根茎[1]。主产于广东湛江徐闻县，广泛分布于我国广东、广西、海南、云南、台湾等地区[2]。

挥发油是高良姜的主要活性成分之一，具有镇痛止呕双重药理作用[3]。由于其良好的抑菌性及抗氧化作用[4-5]，其应用范围广泛，除药用外，还常作为香料添加至食品以及香水等日化用品中[6-8]。高良姜挥发油中的1,8-桉叶素在2005年版《中国药典》里被作为高良姜含量检测的指标性物质[1]。作为辛温类药材，挥发油是判断其质量优劣的指标之一。已有研究表明不同产地和品种的高良姜挥发油的组成成分及其含量差异显著[9-12]。

气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术在分析未知复杂样品，常出现谱库中几个化合物与同一色谱峰进行匹配，无法得到准确结果。引入保留指数（retention index，RI）作为质谱定性分析的补充和验证十分有效[13-14]。在同一柱上，物质的RI与柱温呈线性关系[15]。采用RI与MS共同定性，可使准确度大大提高[16-18]。国内关于高良姜挥发油的成分分析多采用MS直接定性，较少利用RI进行验证。

指纹图谱波谱、色谱等现代分析是一种考察复杂成分均一性和稳定性的质量控制模式[19-22]。道地药材较其他地区所产的同种药材品质佳、疗效好，具有较高知名度[23]。鉴于各种药材中化学成分复杂，指纹图谱技术作为可量化的综合鉴定手段，在特定产地的药材品种鉴别、品质考察和控制、品级划分及评价中起到重要作用[24]。

为了更深入研究广东湛江徐闻高良姜这种道地药材，本研究利用GC-MS联用技术结合RI验证，对广东湛江徐闻高良姜1～5 a生长年份的挥发油主要成分进行定性，采用峰面积归一化法进行相对定量分析对比研究。同时建立高良姜挥发油指纹图谱，有望为当地高良姜的质量控制及合理开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5 批高良姜，1～5 a生长年份鲜姜各1 批，每批100 kg，从徐闻原产地收集采购，经清洗干燥粉碎得姜粉备用；市售干姜3 批，每批20 kg，从市面药店采购，直接粉碎得姜粉备用。原植物标本经中国热带农业科学院农产品加工研究所广东省级现代农业（热带农产品加工与检测）产业技术研发中心鉴定为姜科植物高良姜。

正构烷烃C7～C30标准品、α-蒎烯标准品、1,8-桉叶素标准品、松油烯-4-醇标准品、α-松油醇标准品、α-法尼烯标准品，正己烷（色谱纯） 德国Sigma公司；无水硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

QP2010-Plus GC-MS联用仪、AOC5000三合一自动进样器、GC-MS Real Time Analysis色谱工作站 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品制备

参考文献[1]，分别取1,8-桉叶素标准品25、50 μL以正己烷稀释20 倍至1.5 mL样品瓶中制备标准品溶液，用于GC-MS联用定性和定量分析。

通过外标2 点法进行定量分析，计算每100 g干药材中1,8-桉叶素质量分数，公式如下：

取α-蒎烯标准品、松油烯-4-醇标准品、α-松油醇标准品、α-法尼烯标准品各50 μL，以正己烷稀释20 倍至1.5 mL样品瓶中制备标准品溶液，用于GC-MS联用定性分析。

1.3.2 供试品制备

取上述姜粉各50 g，参考文献[1]进行制备，平行提取3 次，计算其误差值。挥发油相对含量计算公式如下：

上述所得挥发油经无水硫酸钠干燥后取50 μL，以正己烷稀释20 倍置1.5 mL样品瓶中制备供试品溶液，用于GC-MS联用仪检测分析。

1.3.3 GC-MS条件

Rtx®-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：60 ℃保持6 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至240 ℃，保持10 min；进样温度250 ℃；载气（He）流速1 mL/min；压力57.4 kPa；分流比30∶1；进样量1 μL。

电子电离源；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；溶剂延迟2.5 min；数据采集方式全扫描；质量扫描范围m/z 40～450；检测器增益电压1.18 kV。

检索数据库为NIST Chemical Structures库（美国国家标准研究所数据库，2014版），Wiley Library库（威廉图谱库，第九版）。

1.4 数据处理

1.4.1 RI的计算

取C7～C30正构烷烃标准品，以正己烷为溶剂配制体积分数为0.1%的溶液，采取1.3.1节和1.3.2节相同的分析条件进行分离，测定各物质的保留时间。各成分的RI按下式计算：

式中：tx为被分析组分流出峰的保留时间/min；tn为碳原子数为n的正构烷烃流出峰的保留时间/min；tn+1为碳原子数为n+1的正构烷烃流出峰的保留时间/min；且tn＜tx＜tn+1。

1.4.2 标准偏差与相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）的计算[25]

对不同生长年份高良姜1,8-桉叶素含量标准偏差值进行计算，用来表示各年份的1,8-桉叶素含量间差异的大小。对不同生长年份高良姜主要成分峰检测分析的保留时间RSD值进行计算，可验证各组分峰分析结果的准确度、稳定性和重复性。

2 结果与分析

2.1 不同生长年份高良姜挥发油含量

表1 不同生长年份高良姜挥发油含量（n=3）Table1 Volatile oil contents of galangal with different ages (n= 3)

由表1可知，平行提取3 次后，以4 a生的高良姜挥发油含量稍高，颜色最深。

2.2 不同年份高良姜挥发油中1,8-桉叶素含量

1,8-桉叶素具有杀虫、抗菌、疏风解热、祛湿解毒的药理活性，辅助药物渗透作用较强[26-28]。经GC-MS分析鉴定、RI验证以及标准品定量（标准曲线y=4.29×106x-378.32），测得不同年份高良姜挥发油中指标成分1,8-桉叶素含量见表2。

表2 不同生长年份高良姜中1,8-桉叶素含量（n=3）Table2 1,8-Cineole contents of galangal with different ages (n= 3)

由表2可知，1,8-桉叶素在各年份的原药材中含量均高于《中国药典》[1]规定的0.15%，第4年的1,8-桉叶素含量略高于其他年份。1,8-桉叶素在各年份药材中含量的标准偏差为0.415%（＜0.5%），表示1,8-桉叶素在各年份药材中的含量差异小。表明不同生长年份高良姜药材中的1,8-桉叶素含量基本稳定。

2.3 不同年份高良姜挥发油主要特征性挥发化合物的比较分析

表3 不同年份高良姜挥发油中主要特征性挥发化合物的比较分析Table3 Comparative analysis of the main characteristic compounds in volatile oil samples from galangal with different ages

将各年份挥发油经1.3.3节所测得的组分峰用NIST Chemical Structures库和Wiley Library库进行检索，结合文献[10,16]中的RI，以质谱匹配度和RI匹配度最高的化学结构为最佳鉴定结果，可信度更高。同时采用峰面积归一化法确定各组分相对含量。经鉴定后，结合以往文献分析结果及药理活性选择其中25 种主要挥发性化合物[9-12,16,19]进行比较分析，所得结果按洗脱顺序列于表3。不同生长年份的高良姜挥发油主要挥发性成分组成相似，仅是比例有差别。结果表明，1,8-桉叶素为高良姜挥发油中的主要成分，与文献[9-12]报道相同。高良姜挥发油主要由萜烯类、醇类、酯类、酮类、醛类以及氧化物类化合物组成；各组分比例存在较大差异，通过总峰面积对各类组分不同年份的含量差异进行对比分析，见图1。由图1可知，高良姜挥发油中的6 类物质相对含量最高的是萜烯类化合物，其次是醇类化合物，第3是酮类化合物。随着生长年份的延长，这6 类物质中萜烯类和氧化物类物质呈现相对含量前4 a持续上升，到第5年下降的趋势；醇类物质呈现相对含量前3 a持续上升，第4、5年逐渐下降的趋势；酮类、酯类、醛类物质相对含量呈现随生长年份的延长而增加的趋势；酯类相对含量较低反映高良姜挥发油不属于酯类油。综合结果表明4 a生的高良姜挥发油各组分总量最高，与表1中4 a生的姜油颜色最深的结果相符。

图1 不同年份高良姜挥发油各类组分的含量差异对比Fig.1 Comparison of the contents of compound classes in volatile oils from galangal with different ages

2.4 高良姜挥发油指纹图谱的建立

表4 高良姜挥发油主要特征峰保留时间Table4 Main characteristic peaks with relative retention time of volatile oils from galangal with different ages

通过对5 批不同生长年份高良姜挥发油样品进行检测，对在上述研究主要的25 个特征峰保留时间进行比较，5 批不同年份挥发油保留时间的RSD均小于0.1%，表示准确度高，反映GC-MS色谱仪具有较好的稳定性和精密度，分析结果可靠，结果见表4。

将5 批不同生长年份的挥发油样品GC-MS数据，经处理后得高良姜GC-MS指纹图谱，见图2。通过GC-MS指纹图谱的辨认，上述研究中所鉴定的25 个主要特征性成分峰在5 批样品中均可明确检出，构成徐闻产区高良姜挥发油指纹图谱的稳定特征峰，并用此指纹图谱对3 个市售挥发油样品进行辨认，尽管样品之间各峰的表观丰度有差异，但整体峰形非常相似，可确认3 个市售产品为正品高良姜。

图2 高良姜挥发油GC-MS指纹图谱Fig.2 GC-MS fi ngerprints of volatile oils from galangal with different ages

3 结 论

挥发油有辅助药物透皮吸收的作用，是衡量辛温类中药质量和疗效的指标之一[29-30]。高良姜药材中挥发油含量较高，辛香气味长久以来是判断其药材质量优劣的一个重要指标[31]。

本研究通过对徐闻产区高良姜1～5 a生长年份的挥发油含量、指标成分1,8-桉叶素含量及主要成分进行对比分析，发现4 a挥发油含量略高于其他生长年份；各年份药材中的1,8-桉叶素含量保持稳定；不同年份挥发油成分组成类似，但各组分比例存在较大差异。通过本研究发现高良姜的指标性成分l,8-桉叶素的含量，随生长年份的延长基本保持稳定。然而药效是各方面的，全面评价不能仅以一个组分的含量决定[10,16]。单味中药所含主要活性成分比例变化对药效的影响经常被中药质量评价研究所忽视。高良姜挥发油包含萜烯类、醇类、酯类、酮类、醛类以及氧化物类6 类化合物，其中萜烯类化合物占主要地位。萜烯类和氧化物类物质相对含量呈现前4 a持续上升，第5年下降的趋势；醇类物质相对含量呈现前3 a持续上升，后2 a逐渐下降的趋势；酮类、酯类、醛类物质相对含量呈现随生长年份延长而增加的趋势；这是以1,8-桉叶素为指标成分所不能反映的。因此对药材的质量评价不仅要考虑某个活性成分的含量，同时应增加能反映活性成分各类比例的质量评价方法。

本研究通过对不同年份的挥发油主要特征性挥发成分的比较分析，建立高良姜挥发油GC-MS联用指纹图谱，为高良姜的质量控制提供理论基础。GC-MS联用指纹图谱能较全面、综合、准确地反映挥发油的组分质量情况[19-22]。通过5 批徐闻地区不同年份高良姜挥发油中主要特征峰的定性分析，形成徐闻地区高良姜挥发油的指纹图谱，应用于市售3 批挥发油样品进行辨认，虽然各峰的表观丰度有差异，但整体峰形非常相似，可确认其为正品高良姜。因此，通过寻找构成挥发油指纹的特征峰，有利于对挥发油整体性和模糊性评价，可为控制辛温类药材内在品质提供一定的依据。