康复新液对博来霉素诱导大鼠肺纤维化模型的治疗作用

徐秋颖， 刘伟伟， 王宝家， 马秀英， 高永翔

肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是许多病因各异的肺间质疾病的共同结局，是以肺泡持续性损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积而导致肺组织反复破坏、修复，最终造成肺组织中的大量胶原沉积为病理特点的一类疾病[1]。组织器官纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因，统计表明，特发性PF患者从疾病诊断到死亡的时间2～5年，5年生存率仅20%[2]。临床上，这类患者多使用糖皮质激素治疗，但是只有1/3的患者对糖皮质激素有一定的疗效，并且长期使用糖皮质激素会出现很多不良反应，导致机体免疫力下降，伤口难愈合等[3]。目前国际公认的最有效的治疗方式是肺移植。但是肺移植存在肺供体少、手术风险大、技术要求高、价格昂贵等缺点,很难在PF的治疗中广泛应用。因此, 拓展新的治疗措施具有重要的意义。

康复新液是由美洲大蠊[拉丁学名：Periplanetaamericana(L.)]干燥虫体的乙醇提取物制成的溶液，其主要成分包括氨基酸(17 种以上，包含人体必须氨基酸)、肽类(抗菌肽、咽侧体抑制神经肽、焦激肽等)、多糖类(硫酸粘多糖等)、核苷类(肌酐、次黄嘌呤、尿嘧啶等)及油脂类等[4]。康复新液可“通利血脉，养阴生肌”，内服可治消化道出血与溃疡等，外用可疗金疮、外伤等，具有改善黏膜创面微循环、加速机体病损组织修复再生、增强免疫等功能[5]。研究显示，康复新液可改善实验性结肠炎，治疗小儿手足口病、带状疱疹、干症、头颈部恶性肿瘤等[6]。本研究旨在从干预PF的角度，对中成药康复新液进行二次开发再评价，从而给康复新液对PF疾病的治疗提供新的依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1动物 Wistar大鼠[成都达硕实验动物有限公司许可证号：SCXK(川)：2013-24]，饲养于成都中医药大学温江实验楼。

1.1.2主要药物及仪器 康复新液(批号：B170314，四川好医生攀西药业有限责任公司)；地塞米松(批号：161236，浙江仙琚制药股份有限公司)；博来霉素(blcomycin,BLM，批号：A0405A，大连美仑生物技术有限公司)；正置光学显微镜(NIKON-E200，日本尼康公司)；电脑自动脱水机(TSJ-SD，常州市中威电子仪器有限公司)；BMJ型包埋机(JB-P5，常州市中威电子仪器有限公司);病理切片机(HM325，赛默飞世尔中国科技公司)。DAB显色剂(批号：K5007， 丹麦DAKO公司)；TRIzolTMLS Reagent(批号：A33252，美国ThermoFisher公司)；反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(批号：FSQ-201，日本 Toyobo公司);SYBRTMGreen Realtime PCR Master Mix(批号：QPK-201， 日本Toyobo公司);Fibronectin抗体(批号：ab2413 ，英国Abcam公司);α-SMA抗体(批号：ab124964，英国 Abcam公司);HRP标记羊抗鼠与羊抗兔(批号：511103与511203，成都zenbiosciene公司);RIPA裂解液(批号：P0013B，南京byeotime生物技术有限公司);PVDF(批号：IPVH00010，美国 Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组 Wistar大鼠48只，雌雄各半，随机分为对照组、模型组以及模型鼠康复新液治疗组(康复新液组)、地塞米松阳性对照组(DXM组)。

1.2.2造模 大鼠腹腔注射麻醉，除对照组外,其他各组参照文献[7-8]方法气管内一次性注射BLM 5 mg/kg建立PF大鼠模型；对照组则注射等体积的生理盐水。

1.2.3给药 康复新液组采用康复新液治疗，剂量为5 mL·kg-1·d-1 [9-10]；DXM组采用DXM治疗，剂量为0.25 mg·kg-1·d-1。灌胃周期均为21 d。

1.2.4标本处理 用股动脉放血的方式处死大鼠。打开大鼠胸腔，取出全肺组织，使用生理盐水冲洗，冲洗后取左肺组织，固定于10%甲醛中24 h，石蜡包埋,切片,进行H-E、马松(Masson)染色。取右肺组织保存于DEPC水处理过的EP管中,分组标记后转移到-80 ℃冰箱冻存,用于后续实时定量PCR及WB检测，方法参照文献[11]。

1.2.5实时定量PCR方法 使用TRIzolTMLS Reagent进行RNA抽提，NanoDrop2000测定RNA浓度，并用反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit按照1 μg/10 μL体系进行逆转录，之后以GAPDH为内参，于qRT-PCR仪检测α-SMA，LN，FN，CTGF，Collagen I及Collagen Ⅲ的mRNA表达。20 μL反应体系：Mix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L浓度)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，无核酸酶水6 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s→95 ℃变性 5 s→60 ℃退火延伸30 s，40 个循环。以2-△△Ct法进行相对表达水平的分析。检测引物(由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)名称及序列：

GAPDH-s：GGCAAGTTCAACGGCACA

GAPDH-a：TCTCGCTCCTGGAAGATGG

LN-s：AGCAACTCAGCAGATACCCG

LN-a：CCAGCTCATTTACTCCCGTCA

FN-s：GCACATCCCACCAACAACCC

FN-a：GGACCTCCTCATCTACATTCGGC

α-SMA-s:AATGACCCAGATTATGTTTGAGACCT

α-SMA-a：TCCAGAGTCCAGCACAATACCAG

1.2.6Western-blot方法 称取适量组织样品，按照0.1 g/mL的比例加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，进行组织匀浆，彻底裂解组织，之后在4 ℃下裂解20 min，12 000 r/min离心5 min后收取上清；BCA法测定蛋白浓度，调整浓度至4 mg/mL，加入2×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE分离条带，湿转至PVDF膜，5%BSA封闭1 h后加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3 次后加入对应的HRP标记二抗，37 ℃孵育1 h后用TBST洗涤3 次，加入ECL底物发光液与化学发光成像仪下拍照。

2 结 果

2.1肺组织病理学观察 H-E染色可见：对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡大小相对一致，肺泡间隔无增宽；模型组肺泡大小不一，有的肺泡明显缩小，肺泡间隔不同程度增宽，可见纤维组织增生伴少许炎细胞浸润。与模型组比较，DXM组肺泡间隔明显变窄，炎细胞数量也明显减少；康复新液组的肺泡间隔也有所变窄，但不如DXM组明显(图1A)。Masson染色可见：胶原被Masson染液染成蓝色，对照组大鼠肺组织中胶原染色主要位于小管基底膜及其周围；模型组大鼠肺组织中可见肺泡间隔厚薄不一，并不同程度地被染成蓝色。与模型组比较，DXM组和康复新液组肺组织蓝色区域均明显减少，但DXM组更明显(图1B)。

2.2实时定量PCR检测结果 与对照组比较，模型组的LN，FN及α-SMA mRNA表达明显上调，表明造模后模型组中的LN，FN及α-SMA这3种PF因子表达明显上调，证明造模成功(P<0.001)。与模型组比较，康复新液组的LN，FN及α-SMA mRNA表达明显下调(P<0.001)；与模型组比较，DXM组的LN，FN及α-SMA mRNA表达明显下调，表明康复新液与DXM对PF大鼠的PF有改变作用(P<0.001)；与DXM组比较，康复新液组LN，FN及α-SMA的mRNA表达差别无统计学意义(图2)。

2.3Western-blot检测结果 与对照组比较，模型组的LN,FN及α-SMA 蛋白水平上升明显，说明造模后模型组中的LN，FN及α-SMA这3种PF因子表达上调，证明造模成功。与模型组比较，康复新液组的LN，FN及α-SMA蛋白表达明显下调；与模型组比较，DXM组的LN，FN及α-SMA蛋白表达明显下调，表明康复新液与DXM对PF大鼠的PF有改变作用；与DXM组比较，康复新液组的LN，FN及α-SMA蛋白表达无统计学意义(图3)。

LN: 层连结蛋白; FN:纤维连结蛋白; α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白. 组间比较，△:P<0.01.图2 实时定量PCR检测各组LN,FN及α-SMA mRNA相对表达情况Fig 2 Relative mRNA expression levels of LN，FN and α-SMA in different groups

3 讨 论

PF是一种进行性不可逆的肺部疾病，目前使用的PF动物模型普遍选用经典的BLM诱导的大鼠或者小鼠模型。BLM是临床上常用的抗肿瘤药物，给药后全身各组织均有分布，主要的副作用是肺毒性，可以引起肺泡炎并很快进展为肺间质的纤维化。先前的研究已证实，大鼠气管内一次性灌注BLM可以形成类似人类弥漫性肺间质纤维化的病变[12]。因此，本研究采用BLM复制PF大鼠模型。

肺纤维化的形成过程中，在最重要细胞因子TGF-β1的刺激作用下，成纤维细胞激活并转化成肌成纤维细胞[13]，肌成纤维细胞的胞浆丰富，分泌胶原同时还具有收缩功能，它具备成纤维细胞和平滑肌的双重特性，肌成纤维细胞的形成是造成ECM异常沉积的主要细胞。所以，肺成纤维细胞不断增殖并向肌成纤维细胞转化是PF发生发展的关键所在。这个过程中，肌成纤维细胞会表达α-SMA这种独特的分子，同时大量合成和分泌ECM[14]，从而形成了纤维灶。这期间，α-SMA的增多可显著增强肌成纤维细胞的迁移及收缩能力[15]，进而ECM的合成和分泌功能增强，因此本研究选取了α-SMA作为反应肺纤维化的程度指标。α-SMA表达水平的上调说明成纤维细胞发生了向肌成纤维细胞的转化，相反α-SMA表达的下调也反映了抗纤维化的有效。另一方面，PF形成过程中ECM的作用不容忽视。ECM成分在肺泡和间质内沉积，使纤维组织过度修复不断取代正常的肺组织，进而造成正常肺组织的破坏。ECM的主要成分是FN和LN，FN可以诱导胶原的形成，从而导致脏器的纤维化[16]。生理情况下ECM处于一个动态平衡的状态，使FN，LN及胶原的合成与降解基本一致，不会出现ECM的过度积聚而形成纤维化，反之这个动态平衡如果被打破，ECM的降解减少，脏器则可能会出现纤维化病变[17]。所以本研究还选取了LN和FN作为反应肺纤维化的程度指标。LN和FN表达水平的上调说明出现ECM沉积，出现组织的纤维化，相反则说明抗纤维化有效。因此，本研究选取LN，FN及α-SMA这3种反映肺部纤维化程度的因子作为治疗药物康复新液及DXM对PF是否有效的客观指标。

LN:层连结蛋白; FN:纤维连结蛋白; α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白； 1:对照组； 2：模型组； 3:康复新液组； 4:地塞米松组.图3 WB检测各组LN，FN及α-SMA 3种蛋白表达情况Fig 3 Protein expression levels of LN, FN and α-SMA in different groups

本研究结果显示，在给予康复新液进行药物干预后，显微镜下观察显示，康复新液组与模型组肺组织比较纤维化有明显改善，表明康复新液可以改善PF大鼠模型的肺纤维化程度；实时定量PCR结果显示，模型组肺组织中LN，FN及α-SMA这3种PF因子在mRNA水平表达明显上调，经康复新液治疗后上述指标表达均有所下调，而WB结果与实时定量PCR结果基本一致，表明康复新液可减轻BLM诱导的大鼠PF程度，其作用可能与其下调肺组织中LN，FN及α-SMA蛋白表达有关。康复新液的抗纤维化作用是否还通过TGF-β/Smad或是其他信号通路起作用？由于本实验中康复新液和DXM都可减少PF大鼠的纤维化程度，而与DXM比较，康复新液毒副作用小，作用缓慢且持久。因此，笔者将继续研究康复新液对TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞模型的干预，以探究其分子机制。