肺炎支原体肺炎患儿血清和支气管肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A、肺表面活性蛋白D和Toll样受体2水平变化及临床意义

徐素玲，李 政，张 成

(珠海市人民医院儿科，广东 珠海 519000)

肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae，MP)是社区获得性肺炎的重要病原体，MP是全球范围的呼吸道感染的病原体之一[1-2]，肺炎支原体肺炎(mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)易复发或迁延不愈，大环内酯类药物是治疗MP感染的首选抗生素，但随着MP的耐药率逐年增长，临床上难治性肺炎支原体肺炎(refractorymycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP)逐渐增多[3]，严重危害儿童健康。但到目前为止，MP感染的发病机制尚不十分清楚，有研究发现，肺表面活性蛋白A(pulmonary surfactant protein A，SP-A)、SP-D和Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)信号通路在MP所致的炎症反应过程中起相应的免疫调节作用，其在肺组织中的含量能反应肺组织的炎症状况[4-6]。目前，主要通过支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)来检测肺组织中SP-A、SP-D和TLR含量，而BALF的获取需行支气管肺泡灌洗术，该手术有严格的适应证，且存在创伤、标本不易获取、成本高的缺点，难以在基层医院开展，而血清标本较BALF获取容易，在基层医院即可采集，基于此，本课题检测了MPP患儿血清和BALF中SP-A、SP-D和TLR2的水平并分析其在血清与BALF中水平的相关性，旨在寻找与肺损伤相关的敏感血清学指标。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2015年7月至2017年7月珠海市人民医院儿科收治的确诊为MPP并行支气肺泡灌洗术患儿35例为研究对象，且排除细菌感染、病毒感染、肺结核、真菌感染、儿童哮喘及其他肺疾病等。根据疾病情况将患儿分为MPP组和RMPP组。MPP诊断标准：符合肺炎诊断标准[7]，肺CT影像显示肺叶或肺段实变、不张，血清MP-IgM≥1160或恢复期抗体滴度呈4倍升高；RMPP诊断标准[8]：临床确诊MPP患儿，应用大环内酯类抗生素1周或以上，仍表现发热，临床症状和影像学表现继续加重。RMPP组12例，男6例，女6例，年龄1～10(3.2±1.8)岁；MPP组23例，男12例，女11例，年龄1～9(3.9±1.2)岁。另选取同期住院行支气管镜异物取出术且未合并明显肺部感染患儿10例作为对照组，其中男5例，女5例，年龄11个月至9岁，平均(1.2±0.9)岁。3组患儿一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。全部患者符合支气管镜检查手术指征，经珠海市人民医院医学伦理学委员会批准并签署相应的知情同意书。

1.2主要试剂与仪器MP抗体试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司，SP-A、SP-D、TLR2试剂盒购自武汉华美生物工程公司；高速离心机购自北京白洋医疗器械有限公司，酶标仪购自赛默飞世尔(上海)仪器有限公司，恒温水浴箱购自上海智城分析仪器制造有限公司，超低温冰箱购自合肥中科美菱低温科技股份有限公司。

1.3血清及BALF标本采集MPP组和RMPP组患者在进行支气管肺泡灌洗前30 min内，对照组患者在进行支气管异物取出术前30 min内，抽取外周静脉血 3 mL，于4 ℃ 下3 000 r·min-1离心 10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱待检。RMPP组和MPP组患者支气管肺泡灌洗时间为入院后1～3 d，对照组患儿在取出异物后给予支气管肺泡灌洗，留取灌洗液送检。具体灌洗方法为，患儿采用局部麻醉或全身麻醉，将37 ℃生理盐水0.5～1.0 mL·kg-1注入病变肺段，用100～150 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的负压立即将灌洗液抽回，共灌洗3～4次，灌洗液于4 ℃下3 000 r·min-1离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱储存待检。

1.4血清及BALF中SP-A、SP-D和TLR2水平检测采用酶联免疫吸附试验检测血清及BALF中SP-A、SP-D和TLR2水平。将标准品稀释后加样，标准品孔加入标准品100 μL，待测品孔加入100 μL样品，振荡混匀，37 ℃水浴 2 h，弃去液体，甩干，不洗涤。每孔加生物素标记抗体100 μL，覆上新的板贴，37 ℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，甩干，每孔加辣根过氧化酶标记亲和素工作液 100 μL，覆上新的板贴，37 ℃温育1 h，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，甩干，依序每孔加底物溶液 90 μL，37 ℃避光显色 15～30 min，依序每孔加终止液50 μL，终止反应，在反应终止后 5 min内用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度值。

2 结果

2.13组患儿血清和BALF中SP-A、SP-D及TLR2水平比较结果见表1。RMPP组和MPP组患者BALF和血清SP-A、SP-D、TLR2水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；RMPP组患者BALF中TLR2水平高于MPP组，差异有统计学意义(P<0.05)，2组患者血清和BALF中SP-A、SP-D水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表13组受试者血清和BALF中SP-A、SP-D及TLR2水平比较

组别n血清SP-A/(g·L-1)SP-D/(g·L-1)TLR2/(g·L-1)BALFSP-A/(g·L-1)SP-D/(g·L-1)TLR2/(g·L-1)对照组100.4±0.16.5±5.510.2±3.50.2±0.24.9±2.910.6±4.6MPP组230.7±0.2a20.6±21.5a16.0±6.9a0.6±0.1a20.9±14.8a18.5±6.2aRMPP组120.7±0.2a21.4±4.6a18.3±8.9a0.7±0.1a23.3±29.2a38.8±43.9ab

注：与对照组比较aP<0.05；与MPP组比较bP<0.05。

2.2血清和BALF中各指标相关性血清与BALF中的TRL2水平呈中等相关(r=0.459，P<0.05)，而血清与BALF中的SP-A、SP-D水平无显著相关性(r=0.223、0.175，P>0.05)。

3 讨论

MPP特别是RMPP的发病机制尚不完全明确，目前认为与MP的直接损害和其导致的间接免疫反应有关[9]。临床上这些患儿常存在明显的炎性因子过度释放，应用免疫调节治疗效果较好，提示炎症反应在发病过程中起重要作用。

SP-A与SP-D均属于C型凝集素家族，为糖蛋白多聚体结构，主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial type Ⅱ，ATⅡ)分泌[10]。PIBOONPOCANUN等[11]研究发现，SP-A可明显延缓MP生长，可能在机体发挥非抗体依赖的早期免疫反应中起重要作用。动物实验表明，SP-A可通过干扰表皮生长因子受体的表达抑制黏液的分泌[2]。SP-D能与巨噬细胞、许多革兰阳性细菌、某些革兰阴性细菌及MP等结合，发挥天然的免疫效应，同时具有调节巨噬细胞的作用，介导细菌的凝集及增加病毒的吞噬与清除作用等[3]。SP-A可通过干扰由嗜酸性粒细胞介导针对MP的生物清除效应而减轻呼吸道的炎症和损害。舒林华等[12]研究发现，MPP肺部病变部位患侧BALF中的SP-A与SP-D水平明显高于健侧，认为可能与MP感染AT Ⅱ，导致SP-A与SP-D合成增加，代偿性分泌增高有关。考虑到医学伦理问题，本研究对RMPP和MPP患儿健侧肺不做灌洗术，所以选择气管异物取出术患儿作为对照，结果发现，RMPP和MPP患儿无论是血清还是BALF中SP-A与SP-D水平均明显高于对照组，表明MP感染肺部可导致ATⅡ细胞分泌大量的SP-A与SP-D，从而起到相应的免疫调节作用，提示SP-A和SP-D可作为肺部感染损伤标志物来监测。

TLR是一类跨膜受体，主要功能为激活天然免疫和参与特异性免疫应答的启动，TLR2信号通路在肺组织对抗MP感染而产生的天然应答中起关键作用[4]，MP膜脂蛋白通过TLR2上调单核巨噬细胞中膜结合型细胞间黏附分子-1的表达，在一定程度上影响着MP感染所致炎性反应的强弱[5]。有研究发现，MPP特别是伴有喘息的患儿血清中TLR2和TLR4的表达明显增高，与其MP抗体滴度呈正相关[13]。这些研究表明，TLR2信号通路在MP诱导的炎症反应中起重要作用。本研究发现，RMPP组和MPP组患儿BALF及血清TLR2水平均高于对照组，且RMPP组患儿BALF中TLR2水平更高，提示肺组织局部TLR2水平升高与炎症反应程度密切相关，但条件所限，本次研究获取的只是这些指标在MPP病程中1个时间点的数据，而不是动态观察其变化，能否对MPP及RMPP有临床指导意义尚有待进一步研究。本研究还发现，血清与BALF中SP-A、SP-D水平无显著相关性，血清与BALF中TRL2水平呈中等相关，血清标本获取较BALF容易，因此，动态监测MPP特别是RMPP患儿血清TLR2水平变化可为临床诊断肺部炎症提供一定依据。