抗肿瘤药卡培他滨有关物质分析方法验证

（广东省轻工业技师学院 广东广州 510320）

卡培他滨（Capecitabine）是一种可以在体内转变成5-FU的抗代谢氟嘧啶脱氧核苷氨基甲酸酯类抗肿瘤原料药物，通过体内三步酶链反应转换为5-FU而作用于肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂和干扰RNA和蛋白质（protein）合成。具有临床高效低毒价格低廉的优势，作为一方便、安全、疗效确切的抗癌药，有可能取代5-FU成为胃癌联合化疗方案的基本用药。从2001年美国FDA和2002年欧洲药品管理局（EMEA）批准用于转移性乳腺癌开始，先后获得英国国家健康与临床优化研究所（NICE）和美国国立综合癌症网络（NCCN）权威指南的推荐，在全世界范围已有多项大样本研究证明其在胃癌、肠癌以及乳腺癌中具有生存获益。而在我国，卡培他滨自2001年上市8年来，先后被批准单药和联合治疗转移性乳腺癌、肠癌的辅助治疗和转移性肠癌的一线治疗，直至去年被批准用于晚期胃癌的一线治疗。[1]

本文在国家标准H31022940的基础上结合卡培他滨美国药典USP32版的有关物质控制要求建立了HPLC-UV法测定卡培他滨中有关物质，并对该方法进行方法验证。

一、仪器设备

1.仪器：A gilent1260高效液相色谱仪（紫外检测器）、电子天平

2.色谱条件：[2]

（1）色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（4.6mm*250mm，5μm）

（2）流动相：以甲醇为流动相A，乙腈为流动相B，0.1%醋酸溶液为流动相C，进行梯度洗脱，检测波长：250nm，流速：1.0ml/min，柱温：40℃进样量：10μl，稀释剂：甲醇-乙腈-水（25:3:72）

二、有关物质

卡培他滨成品中可能含有的已知杂质，杂质A（5′-脱氧-5-氟胞苷）、杂质B（5’-脱氧-5-氟脲苷）、杂质C（2′，3′-氧-羰基-5′-脱氧-5′-氟-N-（戊氧基羰基胞嘧啶核苷））、杂质D（2′，3′-二-氧-乙酰基-5′-脱氧-5-氟-N-（戊氧基羰基）-胞嘧啶核苷）、杂质E（2′，3′-二- 氧-乙酰基-5′-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷）、杂质F（5-氟胞嘧啶）、杂质J（5-氟-N-[（戊氧基）羰基]-胞嘧啶）、杂质L1（5′-脱氧-5-氟-N-[（2-甲基丁氧基）碳基]-胞嘧啶核苷）、杂质L2（5′-脱氧-5-氟-N-[（3-甲基丁氧基）碳基]-胞嘧啶核苷）、杂质Q（5’-脱氧-5-氟-N-[（甲氧基）羰基]- 胞嘧啶核苷）。

三、方法验证

1.专属性

（1）各已知杂质及成品的定位分离考察

取稀释剂作空白溶剂，另分别取杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质L1、杂质 L2、杂质H、杂质M、杂质N、杂质K1+K2、杂质O、杂质Q及卡培他滨适量，加稀释剂溶解制成约6ug/ml样品，照本品有关物质检测方法进样检测，记录色谱图。

2.线性范围及各已知杂质校正因子测定

（1）杂质A、B、C、D、E、J、L2、Q低浓度线性

精密称取杂质A15.77 mg、杂质B13.76mg、杂质C15.78mg、杂质D13.94mg、杂质E15.85mg、杂质J13.65mg、杂质L2 14.10mg和杂质Q15.36mg分别置于25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密量取各储备溶液1ml置同一100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为1%对照溶液。精密量取1%对照溶液3ml、5 ml、10ml、20ml分别置100ml、50ml、25ml、25ml的量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得相对1%对照溶液的3%、10%、40%、80%线性溶液。再精密量取储备溶液1ml置50ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得200%线性溶液，分别取上述线性溶液与1%对照溶液各10μl进样检测。[3]

3.精密度考察

（1）重复性考察

取卡培他滨约15mg，精密称定，共6份，分别置于25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取1ml置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别取上述对照溶液和供试品溶液各10μl进样检测，记录色谱图。按加校正因子的主成分自身对照法计算已知杂质的含量，按自身对照法计算其他单个杂质和总杂质含量，并计算相应杂质偏差。

（2）中间精密度考察

取本品适量，按重复性项下的方法，在同一实验室，由不同操作者，于不同日期，使用不同仪器进行检测，并与重复性试验进行比较。[4]

4.各已知杂质的回收率

杂质A、B、C、D、E、J、L1+L2和Q的回收率：

分别精密量取加杂质的供试品溶液、不加杂质的供试品溶液和对照品溶液10μl进样检测，记录色谱图，按外标法分别计算杂质A、C、D、 E、J、L1+L2和Q的回收率。

5.溶液稳定性

精密称取卡培他滨约15mg，置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取该溶液于室温下放置0、2、4、8小时后进样检测，同时将该供试品溶液在冰箱（2～8℃）中放置，于0、3、12、24小时后进样检测，记录色谱图，按自身对照法分别计算各已知杂质、其他单个杂质以及总杂质大小。[5]

6.耐用性考察

分别使用正常色谱条件（Inertsil ODS-SP C18柱，250*4.6mm，5μm；）、 不 同 色 谱 柱（Agilent，ZORBAX，XDB-C18柱，250*4.6，5μm；Welchrom C18，250*4.6，5μm）；不同柱温（柱温为35℃和45℃）；不同流速（流速为0.95ml/min和1.05ml/min）；不同初始流动相比例（甲醇-乙腈-0.1%醋酸=23:3:74、甲醇-乙腈-0.1%醋酸=27:3:70）进行测试，以面积归一化法分别计算供试品溶液杂质个数和杂质大小，主峰理论板数，主峰与相邻杂质的分离情况，以及各杂质的相对保留时间。

四、验证结果

项目验证结果专属性（1）空白溶剂不干扰样品及杂质的测试；（2）原材料、中间体、各已知杂质和未知杂质均能与主峰良好分离（3）降解后主峰含量在81.3%～98.9%之间，与降解后主峰HPLC纯度差异小于5.0%，物料平衡，且降解后杂质与主峰能良好分离、降解样品中主峰的峰纯度均大于999；空白溶剂不干扰主峰及降解杂质的测定；线性范围、各已知杂质校正因子测定杂质A：在0.1892～12.62μg/ml 浓度范围内，相关系数为1 ；校正因子为0.98杂质B：在0.1651～11.01μg/ml 浓度范围内，相关系数为1 ；校正因子为1.26杂质C：在0.1894～12.62μg/ml浓度范围内，相关系数为0.9993；校正因子为1.06杂质D：在0.1639～10.93μg/ml浓度范围内，相关系数为1；校正因子为1.15杂质E：在0.1885～12.566μg/ml浓度范围内，相关系数为1；校正因子为1.10杂质J：在0.1609～10.72μg/ml浓度范围内，相关系数为1；校正因子为1.09杂质L1：在0.1686～8.432μg/ml浓度范围内，相关系数为0.9995；校正因子为1.03杂质L2：在0.1658～11.05μg/ml浓度范围内，相关系数为1；校正因子为1.06杂质Q：在0.1812～12.081μg/ml浓度范围内，相关系数为0.9995；校正因子为1.32卡培他滨：在0.1900～12.67μg/ml浓度范围内，相关系数为0.9995检测限以各杂质在样品中的含量表示：杂质A：检测限为0.001%； 杂质B：检测限为0.001%；杂质C：检测限为0.002%； 杂质D：检测限为0.002%；杂质E：检测限为0.001%； 杂质H：检测限为0.001%杂质J：检测限为0.001%；杂质K1：检测限为0.001%；杂质K2：检测限为0.001%；杂质L 1：检测限为0.002%；杂质L2：检测限为0.001%； 杂质M：检测限为0.001%；杂质N：检测限为0.001% 杂质O：检测限为0.001%；杂质Q：检测限为0.001%；以各杂质在样品中的含量表示：杂质A：定量限为0.002%；6针样品峰面积RSD为0.99%；杂质B：定量限为0.004%；6针样品峰面积RSD为0.88%；杂质C：定量限为0.007%；6针样品峰面积RSD为1.22%；杂质D：定量限为0.006%；6针样品峰面积RSD为1.42%；杂质E：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为0.88%；杂质H：定量限为0.002%；6针样品峰面积RSD为0.40%；杂质J：定量限为0.004%；6针样品峰面积RSD为1.05%；杂质K1：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为0.76%；杂质K2：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为1.92%；杂质L1：定量限为0.006%；6针样品峰面积RSD为0.39%；杂质L2：定量限为0.005%；6针样品峰面积RSD为1.95%；杂质M：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为1.07%；杂质N：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为1.59%；杂质O：定量限为0.002%；6针样品峰面积RSD为1.15%；杂质Q：定量限为0.004%；6针样品峰面积RSD为1.54%；卡培他滨：定量限为0.003%；6针样品峰面积RSD为1.25%。检出限加入 该方法能检出残存的杂质K1和K2、杂质E、杂质H、杂质J、杂质M、杂质N和杂质O定量限重复性：6份样品任一单个杂质RSD及总杂质RSD分别为：杂质A：5.51%；杂质B：6.81%；杂质C：0；杂质L1+L2：0%；杂质D：未检出；杂质E：未检出；杂质J：未检出；杂质H：未检出；杂质K1+K2：未检出；杂质Q：未检出；杂质M：未检出；杂质N：未检出；杂质O：未检出；总杂质：2.50%。精密度中间精密度：6份样品任一单个杂质RSD及总杂质RSD分别为：杂质A：10.29%；杂质B：0；杂质C：0；杂质L1+L2：5.84%；杂质D：未检出；杂质E：未检出；杂质J：未检出；杂质H：未检出；杂质K1+K2：未检出；杂质Q：未检出；杂质M：未检出；杂质N：未检出；杂质O：未检出；总杂质：5.35%。精密度项下的12份样品：任一单个杂质RSD及总杂质RSD分别为：杂质A：7.63%；杂质B：10.29%；杂质C：0；杂质L1+L2：4.12%；总杂质：4.27%

溶液稳定性室温条件：样品溶液在4小时内杂质A变化的绝对偏差为0.013%，其他杂质的绝对偏差均小于0.005%，总杂质的绝对偏差为0.015%，在4小时内未见新增杂质产生；即样品溶液在室温条件下4小时内稳定。低温条件（2～8℃）：样品溶液在24小时内杂质A变化的绝对偏差为0.008%，总杂质的绝对偏差为0.008%，在24小时内未见新增杂质产生；即样品溶液在低温条件下24小时内稳定。各已知杂质的回收率各杂质回收率及RSD分别为：杂质A：回收率为99.9%，RSD为1.08%；杂质B：回收率为99.0%，RSD为0.87%；杂质C：回收率为99.3%，RSD为1.31%；杂质D：回收率为99.6%，RSD为0.85%；杂质E：回收率为99.4%，RSD为1.10%；杂质J：回收率为99.6%，RSD为0.53%；杂质L1+L2：回收率为99.8%，RSD为0.93%；杂质Q：回收率为100.8%，RSD为0.75%。耐用性色谱柱：Agilent ZorbaxXDB-C18柱，250*4.6mm，5μm；Welchrom C18，250*4.6mm，5μm。流速：1.0±0.05ml/min；柱温：40℃±5℃；初始流动相比例：甲醇-乙腈-0.1%醋酸=（25±2）:3:（72±2）的微小变化对检测结果无影响，各杂质的相对保留时间比较稳定，变化均在±0.05范围内。

结语

通过卡培他滨中有关物质的专属性、系统适用性、低浓度线性、各已知杂质的回收率、各已知杂质和未知杂质的检出限、定量限以及未检出的已知杂质的检出限加入试验、精密度测定、溶液稳定性考察和耐用性考察试验，验证试验表明该色谱条件专属性强、低浓度线性关系好、检出灵敏度高，精密度好，溶液室温4小时稳定，在低温条件下（2℃～8℃）24小时内稳定，且各已知杂质测定的准确度高，色谱系统在流速（1.0±0.05ml/min）、柱温（40±5℃）、流动相比例[流动相：0.1%醋酸-甲醇-乙腈=72:（25±2）:5，]的微小变化下，不影响有关物质的测定结果，各已知杂质相对保留时间稳定，系统适用性符合测定要求，上述条件耐用性好。可用卡培他滨原料药和制剂的有关物质检查，进行质量控制，也可为其它氟化嘧啶类物质研究提供参考。