艾灸对阳陵泉穴区皮肤组织五羟色胺和组胺的影响

陈虹,徐东升,杨金生,白万柱,闫平慧,王莹莹



艾灸对阳陵泉穴区皮肤组织五羟色胺和组胺的影响

陈虹1,徐东升2,杨金生2,白万柱2,闫平慧1,王莹莹2

(1.陕西中医药大学,咸阳 712046;2.中国中医科学院针灸研究所,北京 100700)

运用免疫组化结合共聚焦技术揭示艾灸对阳陵泉穴区皮肤组织五羟色胺(5-HT)、组胺(HA)的影响。以大鼠为实验对象,剃除双后肢阳陵泉穴区毛发,充分暴露皮肤组织,对左侧阳陵泉穴进行艾灸治疗,灸后即刻灌流,并分别取两侧穴区皮肤组织(1 cm×1.5 cm),经25%高渗糖脱水后用冰冻切片机制成20mm系列组织切片,然后分别用5-HT及HA抗体进行荧光免疫组化检测。艾灸后皮肤组织中5-HT和HA阳性表达明显增强,5-HT分别在表皮层与真皮层之间,皮下组织层沿血管形成连续的增强带;HA主要集中分布在真皮层深部及皮下组织的血管旁。通过显微镜计数,艾灸后皮肤组织中5-HT和HA阳性标记数量明显高于正常皮肤组织,差异均具有统计学意义(＜0.05)。艾灸能够使阳陵泉穴区皮肤组织中5-HT和HA的表达上调,其可能参与艾灸作用通路的信息传递。

灸法;五羟色胺;组胺;穴,阳陵泉

艾灸是通过温热刺激及药物作用治疗疾病的中医传统外治法[1]。在我国古代,热灸疗法早于针刺疗法[2],至今仍广泛应用于临床治疗。以往研究从热灸刺激信号的传导通路入手,认为艾灸的作用机制为热灸刺激产生的物理和化学因子作用于腧穴感受装置,通过外周传入途径,刺激信号传入中枢,经过信号整合传出,从而起到调控作用[3-4]。然而这些研究基本是在宏观和大解剖学水平上进行的,而对于艾灸过程中的活性物质参与及其级联反应的研究,目前鲜有报道。

近年来,随着体表医学研究的深入,体表刺激的直接作用部位穴区成为研究热点,现已对穴区皮肤组织血管和神经纤维的结构特征进行了相关研究[5],并发现正常穴区局部存在组织细胞化学动态变化[6],这为我们更深入了解穴区局部组织结构和物质的构成提供了新的视角。为了进一步了解艾灸对穴区活性物质动态变化的影响,本实验拟以健康SD大鼠为研究对象,运用免疫组化结合激光共聚焦技术,观察和比较穴区正常皮肤组织和艾灸皮肤组织中活性物质五羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)和组胺(histamine, HA)的变化,以探索艾灸作用信息的传导通路,现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级成年雄性SD大鼠6只,体质量为(220±10)g,由中国医学科学院动物所提供[实验动物许可证号SCKX(军)2007-004]。实验过程参照并严格遵守美国国立卫生研究院的《实验动物照料和使用指南》。

1.2 试剂与仪器

异氟烷(九派制药有限公司,中国)、兔抗5-HT抗体(rabbit anti5-HT, ab10385,Abcam,香港)、兔抗HA抗体(rabbit antiHA, ab123982, Abcam,香港)、Alexa 594荧光素化的山羊抗兔二次抗体(goat anti- rabbit Alexa 594secondary antibody, Molecular Probes,美国)、核酸特异性荧光染料DAPI(40,6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Mo- lecular Probes,美国)、Alexa 488荧光素化的鬼笔环肽(Alexa fluor 488 phalloidin, MolecularProbes,美国)。

小动物麻醉机(VMR, Matrx, Midmark,美国)、蠕动泵(BT300-2J,保定兰格恒流泵有限公司)、阳离子载玻片(Thermo, Erie Scient if ic Company,美国)、恒冷箱切片机(FSE, Thermo, MicromInternational,德国)、研究级正置显微镜(Olympus, BX53,日本)、全光谱扫描共聚焦显微镜(Olympus, FV1200,日本)。

1.3 艾灸治疗

取双侧阳陵泉穴,左侧进行艾灸刺激,右侧为对照。定穴参考《实验针灸学》[7]中大鼠常用针灸穴位定位法,即阳陵泉位于腓骨头前下方凹陷处,距“后三里”穴上外侧5 mm处。采用小动物呼吸麻醉机对SD大鼠进行诱导麻醉,分别剃除大鼠双后肢阳陵泉穴区毛发,充分暴露皮肤组织,使用艾条对左侧阳陵泉穴区进行艾灸治疗。艾条为大鼠动物实验专用,呈圆柱状,直径为4 mm,长120 mm,重量为6 g。艾条与皮肤垂直距离(3±0.5)cm,测温枪监测穴区体表温度使其保持在(44±0.5)℃,艾灸治疗10 min。详见图1。

图1 大鼠阳陵泉穴定位及艾灸操作

1.4 灌流取材

艾灸刺激后即刻对仍处于深度麻醉状态下的大鼠进行心脏灌流。具体操作为,迅速剪开胸腔,经左心室将输液针管插入升主动脉,剪开右心耳,快速灌入生理盐水100 mL,随后灌入(320±10)mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸缓冲液(phosphate bufferedsolution, PB, pH值为7.4)的固定液,约15 min灌流完毕。在灌流后大鼠两侧阳陵泉穴区分别纵向切取长约15 mm、宽约10 mm的皮肤组织,将其放置于上述同样固定液中固定2 h,再换到含25%蔗糖的0.1 mol/L PB液(pH值为7.4)中,放置于4 ℃冰箱中约2 d,直至组织完全下沉。

1.5 组织切片制备

采用恒冷箱切片机进行组织切片。先用组织包埋剂将皮肤组织黏贴在支架上,待冻结后将组织制成厚20mm的矢状切片,直接贴在阳离子载玻片上,并按顺序分为两组(艾灸组织与正常组织),然后放置于室内阴干。

1.6 观察指标及检测方法

两组组织切片用0.1 mol/L PB液清洗3次,并用组化笔在组织周围画圈,将封闭液[3%山羊血清,0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH值为7.4)]用移液器滴加到组织切片上孵育0.5 h,移去封闭液,分别滴加一次抗体兔抗5-HT抗体(1:500)和兔抗HA抗体(1:500)的稀释液[1%山羊血清、0.5% TritonX-100和0.1 mol/L PB(pH值为7.4)],并将装有组织切片的湿盒置于4℃冰箱中过夜。次日经0.1 mol/L PB液清洗后,加入含Alexa 594荧光素化的山羊抗兔二次抗体(1:500)、Alexa 488荧光素化的鬼笔环肽(1:50000)、核酸特异性荧光染料DAPI(1:1000)的上述稀释液,于室温内静置1.5 h后,用0.1 mol/L PB液清洗3次。待组织切片风干后,滴加50%甘油,加盖玻片完成标本制作。整个操作过程中注意避光。

组织标本用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察和拍照。图片经Adobe Photoshop CS2(Adobe Systems, San Jose, CA,美国)进行标注和编辑。两组组织切片在荧光显微镜10倍视野下分别选取12个面积相同的区域进行5-HT、HA计数,并用GraphPad Prism6软件绘制柱状图。

1.7 统计学方法

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用配对检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

阳陵泉穴区皮肤组织的表皮下、真皮、皮下组织均有5-HT阳性标记,艾灸组织(图2B)较正常组织(图2A)阳性表达增多聚集,并分别在表皮层与真皮层之间及皮下组织层沿血管形成连续的增强带;HA主要分布在正常组织和艾灸组织的真皮层深部及皮下组织的血管旁,但艾灸组织中的HA表达明显上调(图4);相同显微镜视野下5-HT和HA阳性标记数量比较(图3、图5),艾灸组明显高于正常组,差异具有统计学意义(＜0.05)。

需要说明的是,本研究仅对实验结果进行了形态学描述,对其量的分析仅限于相同视野下的阳性表达物数量的统计分析,是为进一步证实其形态学分布趋势而服务,穴区局部皮肤组织中5-HT、HA含量变化可用生物化学技术在后期实验中进行测定。

图3 5-HT阳性表达细胞在正常组织和艾灸组织的计数

注:由HA、鬼笔环肽(Pha)和DAPI标记的阳陵泉穴区,分别显示为红、绿、蓝色,其中Epi、D、Sub分别代表表皮层、真皮层、皮下组织;A为HA在正常组织中的分布;B为HA在艾灸组织中的分布;A和B中箭头的放大部位分别显示HA在深层皮下组织(A1、B1)的分布

3 讨论

本研究运用荧光免疫组化结合共聚焦成像技术,从活性物质变化的角度,探索艾灸刺激可能存在的信息传导通路。通过研究发现,艾灸可使局部皮肤组织中5-HT、HA的表达明显增强;5-HT、HA具有明显的趋血管性分布。

5-HT、HA作为神经递质和免疫调节因子,由存在于皮肤中的内分泌细胞和免疫细胞(包括角质形成细胞、Merkle细胞、树突状细胞以及T细胞等)所分泌[8-11]。本研究结果显示5-HT、HA阳性表达的变化与艾灸刺激对皮肤-内分泌系统和皮肤-免疫系统的激活密切相关。朱兵等[2]证实,艾灸刺激可以通过Ad类纤维和C类纤维兴奋皮肤中的温热感受器和C-多型伤害感受器,感觉神经元通过轴突反射释放神经肽到皮肤的表皮或真皮的神经末稍,介导多种如内分泌细胞和免疫细胞等靶细胞的活性,释放相关激素和活性物质。唐照亮等[12]亦发现艾灸刺激可以通过调节组织源性炎性介质HA、5-HT,减轻或缓解炎症反应,参与免疫调节机制。HA、5-HT具有扩血管作用[13-16],HA还可增加毛细血管的通透性,艾灸对经穴的刺激作用,能激活血管的自律运动,改善局部微循环[17]。所以,笔者推测艾灸后血管周围HA、5-HT的阳性表达增强与艾灸改善局部微循环作用相关。

5-HT、HA可能参与镇痛作用机制的信息传导。HA在脑内对痛觉具有调节作用,在脊髓水平对痛觉具有传导作用[18];在中枢下行的5-HT能神经元能够激活抑制性中间神经元而发挥镇痛作用,在外周5-HT受体能够参与疼痛信号的传导[19]。笔者发现艾灸刺激可以通过对HA、5-HT表达的调控参与镇痛作用机制的信息传导,这与杨介宾等[20]发现艾灸可调控致痛因子HA、5-HT而实现镇痛的效应观点一致。另外,相关临床研究[21-24]和动物实验[25-27]均证明,艾灸能够通过调节结肠的5-HT通路来实现降低肠易激综合征患者或大鼠的内脏痛的程度。

总之,正常情况下皮肤处于稳态结构,艾灸刺激可以打破这种稳态,使其由静止转为激活状态,其中5-HT和HA成分的增加表明其可能参与艾灸作用通路信息传递过程。以本研究为基础,深入探讨艾灸刺激对穴区活性物质的表达变化的影响,不仅有助于在生物学层面上揭示艾灸作用机制的始动环节,而且使灸刺激不同穴区活性物质表达的共性和特异性研究成为可能。本研究结果提示从穴区局部组织入手研究与艾灸始动环节密切相关的物质基础将会成为今后艾灸作用机制研究的一个重要发展方向。

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Effect of Moxibustion on the Expressions of 5-Hydroxytryptamine and Histamine in Skin Tissue at Yanglingquan (GB34)

1,2,2,2,1,2.

1.,712046,; 2.100700,

To investigate the influence of moxibustion on the expressions of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and histamine (HA) in skin tissue at Yanglingquan (GB34) by using immunohistochemistry combined with confocal technique.The rat was used in this experiment. The skin tissue on hind limbs Yanglingquan (GB34) was exposed by shaving. Subsequently, moxibustion was carried out on the left side of Yanglingquan (GB34). After moxibustion, the local skin tissue of 1 cm × 1.5 cm on bilateral Yanglingquan (GB34) of rats were collected, and put into 25% sucrose solution. The tissues were sliced at 20mm on a cryostat. The 5-HT and HA antibodies were used for fluorescent immunohistochemical test.The positive expressions of 5-HT and HA increased in the local skin tissue after moxibustion, in which 5-HT increased between the epidermis and dermis, in subcutaneous tissue layer forming a continuous band of enhancement along the blood vessels, while HA was majorly distributed nearby the blood vessels of deep dermis and subcutaneous tissue. After counting the positively-expressed 5-HT and HA by microscopic field of view, the numbers of 5-HT and HA positive markers were significantly lager in post-moxibustion skin tissue than in normal skin tissue. The differences were statistically significant (＜0.05).Moxibustion plays a role in up-regulating the level of 5-HT and HA in the local skin tissue at Yanglingquan (GB34). It suggests that 5-HT and HA may be involved in the signal transduction of moxibustion-related pathways.

Moxibustion; 5-Hydroxytryptamine; Histamine; Acupoint, Yanglingquan (GB34)

1005-0957(2018)13-0103-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.13.0103

2018-02-12

国家自然科学基金项目(81674079);北京市自然科学基金项目(17G40199)

陈虹(1988—),女,2015级硕士生,Email:799678916@qq.com

王莹莹(1981—),女,主任医师,博士,Email:YYW261206@126.com