草分枝杆菌胞壁肽聚糖的分离提取和鉴定

王小柱

（辽宁省畜产品安全监察所，辽宁 沈阳 110003）

草分枝杆菌（Mycobacterium phlei，M.phlei）是一种从牧草中最先分离纯化出来的耐酸杆菌，在土壤、植物和饮水中广泛分布。灭活后的草分枝杆菌对人畜无致病性，具有抗菌、调节肠道微生物平衡、提高免疫力、提高食物消化利用率等功能[1]。分枝杆菌细胞壁由肽聚糖（PG）、脂多糖（LPS）、磷壁酸（TA）、类脂A相关蛋白（LAP）、表面相关物质（SAM）等多种活性成分构成。肽聚糖是革兰阳性菌等原核生物细胞壁特有的组分，可作为真核免疫系统识别的理想靶位[2-3]。目前，肽聚糖提取分离均采用Sekine建立的双歧杆菌完整肽聚糖提取法。但该法试验步骤繁琐，整个过程需要15 d左右，耗时长，得率低。宋晓玲等在试验基础上进一步改进了孟凡伦的方法，只用1周时间即可制得双歧杆菌的粗提肽聚糖产品[4-5]。此法既节约时间又简便易行。本试验在此方法上对超声破碎辅助提取草分枝杆菌肽聚糖进行了初步研究，为草分枝杆菌在工业、农业、医药和食品领域的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂材料：以实验室冷藏斜面保存草分枝杆菌为试验材料。

试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、ddH2O、胰蛋白酶、Tris-Hcl（pH=7.5）、乙酸钠、氯仿、甲醇、葡萄糖标准溶液、溶菌酶。

1.2 设备与仪器GL21M高速冷冻离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；HZQ-F170震荡培养箱，哈尔滨市东联生化仪器；UV-2500紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SCIENTZ-650E超声波细胞粉碎机，浙江新芝生物科技股份有限公司；1260型液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草分枝杆菌的培养

1.3.1.1 菌种活化首先用60℃水浴加热冷藏的装有已纯化的草分枝杆菌管，10 min后取出，在固体琼脂培养基板中划线接种，37℃条件下培养24 h，枪头挑取单克隆菌落，接种于50 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，振荡培养12 h。

1.3.1.2 生长曲线的测定取培养好的草分枝杆菌，以2%接种量转接液体培养基，37℃、220 r/min培养24 h，定时测定OD600值，并进行细胞计数。

1.3.1.3 扩大培养及菌体收集取单菌落接种于50 mL培养基中，37℃恒温水浴振荡箱中振荡培养，200 r/min，24 h，1%接种于100 mL液体培养基中，180 r/min，37℃振荡培养18 h。离心沉淀收集菌泥，用0.9%生理盐水反复洗涤菌泥至乳白色，计算该菌体湿重。

1.3.2 草分枝杆菌肽聚糖的提取

1.3.2.1 去磷壁酸将上述细菌沉淀用80 w功率，累计超声20 min（超声3 s，间隔2 s）。随后将超声处理的细胞壁沉淀悬浮在10%三氯乙酸中，37℃条件下水浴15 min，冷却至室温。用4 000 r/min，离心18 min收集沉淀，用蒸馏水洗涤3次。

1.3.2.2 去脂质将获得沉淀悬浮于乙酸钠-氯仿-甲醇的混合液中，体积比为4:5:10。静止40 min，4 000 r/min离心30 min收集沉淀。

1.3.2.3 去蛋白将上步得到的沉淀加入到含有1 mg/mL胰蛋白酶，0.1 mol/L，pH=7.5的Tris-Hcl缓冲溶液中，37℃水浴12 h，8 000 r/min离心15 min弃去沉淀，冷冻干燥得白色粉末即为肽聚糖。

1.4 生化特性研究

1.4.1 溶菌酶溶解试验参照金盼盼的方法[6]，用磷酸盐缓冲液（pH=6.2）将提取肽聚糖配成1 mg/mL溶液，加溶菌酶250 μg/mL，在37℃，140 r/min振荡处理22 h，测定OD600。

1.4.2 蛋白质含量的测定以考马斯亮蓝G250为染液，标准参考蛋白BSA，Bradford法测定粗提肽聚糖物的蛋白含量（%）。

1.4.3 总脂肪含量的测定分别量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL胆固醇标准溶液于试管中，同时加入肽聚糖样品1 mg于另外3支试管中，无水乙醇混至1 mL摇匀。然后分别量取0.2 mL，对应加入浓硫酸1 mL，沸水浴20 min充分水解脂类，冷却。随后加入香草醛3 mL，室温静置20 min，测定OD525。绘制标准曲线。

1.4.4 总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。取10支试管，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖标准溶液，另取3支试管分别加入1 mg肽聚糖样品，蒸馏水定量至1 mL；再加入1.0 mL 5%的重蒸苯酚溶液和浓硫酸5 mL，立即摇匀。沸水浴25 min，取出后快速冷却至室温。分别测定各管OD490，以葡萄糖含量（μg/mL）为横坐标，以吸光度OD490为纵坐标绘制标准曲线，测定总糖含量。

1.5 化学结构的分析

1.5.1 红外光谱分析用溴化钾（KBr）将肽聚糖提取物压片，在4 000～370 cm-1范围内用傅里叶变换红外光谱分析仪扫描分析。

1.5.2 SDS-PAGE分析肽聚糖分子量用pH=6.2的PBS将肽聚糖提取物配成1 mg/mL，加入200 μg/mL的溶菌酶，37℃消化12 h。然后从中取1 mL样品，3 000 r/min离心除去蛋白质，取上清。用5%浓缩胶，12%分离胶进行电泳。

2 结果与分析

2.1 生长曲线测定结果由草分枝杆菌生长曲线可知，在0～5 h内处于初始期，在5～15 h内处于对数期，在16～20 h时处于平缓期。在18 h草分枝杆菌达到对数生长期末期，其生长量最大，OD值为1.843，活菌数为7.3×108/mL。

2.2 PG得率计算草分枝杆菌由10.78 g（细胞干重）获得粗制肽聚糖1.43 g，获得率13.33%。

肽聚糖得率（%）=得到的肽聚糖质量/处理的菌体质量×100%=1.43 g/10.78 g×100%=13.33%

2.3 组成成分及化学结构的分析

图1 草分枝杆菌生长曲线Fig.1 Standard curve ofM.phlei.

2.3.1 溶菌酶溶解测定

表1 PG溶菌酶消化试验Table 1 PG lysozyme digestion experiment

在草分枝杆菌肽聚糖被溶菌酶消化的过程（16 h）中，其吸光度值变化见表1。在8 h内，随水解时间延长，溶液吸光值逐步降低。9 h后吸光值趋于平缓，说明该提取物可被溶菌酶消化降解，为肽聚糖。

2.3.2 蛋白质含量测定 100 μg/mL BSA标准溶液曲线如图2。其回归方程为y=61.382x+0.0081，决定系数R2=0.9996（其中x轴为标准蛋白液的浓度，y轴为595 nm处吸光度值），表明检测蛋白质含量具有较好的线性相关性。3次测量取均值得出肽聚糖样品的平均吸光值是0.255。计算得知，该样品蛋白质含量为4.02 μg/mL，约占肽聚糖样品的4.02%。

图2 牛血清蛋白（BSA）溶液标准曲线Fig.2 Standard curve of BSA

2.3.3 总脂含量的测定 0.1 mg/mL胆固醇母液标准溶液曲线如图3。其回归方程为y=0.9967x-0.0207，决定系数R2=0.9961（其中x轴为标准胆固醇母液的体积，y轴为525 nm处的吸光值），表明检测脂肪含量具有良好的线性相关性。3次测量取均值得出肽聚糖样品的平均吸光值是0.0198由回归方程得，脂肪含量为0.041 mg/mL，由此得出总脂含量为4.1%。

图3 胆固醇溶液标准曲线Fig.3 Standard curve of cholesterol

2.3.4 总糖含量的测定 100 μg/mL葡萄糖标准溶液曲线，如图4。其回归方程为y=0.097x-0.2636，决定系数R2=0.9973（其中x轴为葡萄糖含量，y轴为490 nm处的吸光值），表明检测葡萄糖含量具有良好的线性相关性。3次测量取均值得出肽聚糖样品的平均吸光值是0.6375由回归方程得，总糖含量为38.54 μg/mL，由此得出总糖含量为38.54%。

图4 葡萄糖溶液标准曲线Fig.4Standard curve of glucose

2.4 肽聚糖化学结构分析

2.4.1 红外光谱分析肽聚糖提取物红外光谱图如图5所示。-OH键通常在3 500～3 100 cm-1处有振动伸缩；C-H键通常在3 000～2 800 cm-1处振动伸缩；糖类物质在1 400～1 200 cm-1处也出现峰群振动伸缩；N-H键变角振动出现在1 560～1 520 cm-1处；C-O-H键伸缩振动出现在1 200～1 000 cm-1范围。在判断糖苷键的类型上，α构型吸收峰出现在840 cm-1附近，β型出现在880 cm-1附近[7-8]。根据图5，本试验中从草分枝杆菌细胞壁中提取出的糖为β型肽聚糖。

图5 肽聚糖提取红外光谱分析Fig.5 FITR analysis of peptidogly

2.4.2 SDS-PAGE分析结果电泳结果如图6。1为样品，2为空白。在肽聚糖的电泳试验中，由于其溶解度极低，需先经溶菌酶消化降低肽聚糖分子量，然后对可溶性肽聚糖进行电泳。经染色后为单一条带，大小在55～70 ku之间，由此说明本试验分离的肽聚糖分子量约为62 ku。

图6 肽聚糖提取物SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE of peptidoglycan

3 讨论

从草分枝杆菌中分离提取细胞壁的过程中，首先采用了超声波方法破碎细胞壁，条件为功率80 w，超声时间40 min，处理温度为25℃。随后结合三氯乙酸法从破碎的细胞壁中提取肽聚糖，大大提升了肽聚糖的得率，与乐军等的提取结果大致相同[9-12]。本试验中肽聚糖分离提取得率为13.33%。在提取的肽聚糖中，总糖占38.54%，蛋白质占4.02%，总脂含量占4.1%。肽聚糖是N-乙酰胞壁酸二糖单元和β-（1，4）-糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺以及肽桥与四肽亚单位组成的聚合物。通过对提纯的肽聚糖提取物的化学成分分析和红外光谱及高效液相色谱结构质鉴定，确定提取物主要成分为肽聚糖。由于肽聚糖不易溶于水，最终采用了先用溶菌酶消化降低其分子量，然后进行SDS-PAGE电泳试验，确定出本试验提取肽聚糖分子量约为62 ku。