rTMS联合运动训练对静息态脑网络影响的研究

靳静娜 王 欣 林 雨 张 恺 李 颖 向 芳 刘志朋 杨学军 殷 涛,4#*

1(中国医学科学院 北京协和医学院 生物医学工程研究所，天津 300192)2(天津医科大学总医院神经外科, 天津 300052)3(天津中医药大学第一附属医院外科, 天津 300193)4(中国医学科学院神经科学中心, 北京 100730)

引言

运动能力在日常生活中具有重要的作用。通过外部干预或加强练习，运动执行可更加快速、准确，运动能力可获得提升[1]，它是脑卒中、脑损伤后运动康复的重要生理基础。目前，常用的提高运动能力的方法是运动训练[2-4]。然而，近年来的研究发现，相比单纯的运动训练，重复经颅磁刺激(rTMS)联合运动训练是一种更优的提高运动能力的方法，在脑卒中、脑损伤后的运动康复中具有良好应用前景[5-8]。

为了深入理解rTMS联合运动训练用于提高运动能力时的脑机制，研究者使用脑影像的方法进行了初步探讨。2013年，Takekawa等通过使用单光子发射计算机断层成像术的研究发现，rTMS联合运动训练使左右大脑脑区之间的对称指数发生了改变，且与脑卒中患侧肢体运动功能的改善显著相关[9]。2015年，Kondo等研究者使用神经兴奋性的生理学指标F波，评估了rTMS联合运动训练对运动神经元兴奋性的影响[10]。然而，揭示rTMS联合运动训练对大脑活动影响作用的研究仍然较少，研究结果比较初步，仍然需要开展大量的研究工作。

人类大脑皮层表现出整个大脑区域特定的功能相互连接模式。该连接模式是局部脑区内信息处理和脑区间信息处理的动态整合[11-13]，是可以随外部环境、刺激等因素随时变化的。rTMS不仅可以对刺激靶点脑区产生作用，而且可以影响与刺激靶点相连接的远端脑区的神经活动[14-15]，运动训练可以通过外周肢体的锻炼使相关大脑脑区活动发生改变，涉及前运动皮层、初级运动皮层和后顶叶皮层等多个脑区[16-17]，因此rTMS和运动训练都具有调控脑网络的作用。另外，临床研究发现脑卒中患者多个脑区间的协同工作能力发生改变，如表现出患侧前运动区与初级运动区的连接降低，健侧半球对患侧半球抑制增加，且这些异常的功能性连接与运动功能降低程度显著相关[18-19]。因此，从脑功能连接的角度探寻rTMS促进运动训练，对运动功能改善的脑机制是非常必要的。

本研究采用低频rTMS抑制优势半球的脑活动，非利手执行不熟悉的运动任务，旨在提高非利手的运动功能。使用了相位延迟指数(phase lag index, PLI)的方法，构建rTMS联合运动训练前后的静息态脑功能网络，探讨rTMS联合运动训练对大脑网络连接的影响，进一步揭示rTMS联合运动训练对运动技能提高的神经电活动机制，促进rTMS联合运动训练在运动能力提高方面的应用。

1 方法

1.1 受试者

本研究招募了10名健康男性受试者，皆为在校大学生，年龄为21～26岁。所有受试者无神经损伤史，无家族遗传病史，无药物和酒精滥用史。经过爱丁堡利手判定，所有受试者均为右利手。在实验前48 h内均没有服用咖啡、白酒等刺激性的饮品，实验前保证充足的睡眠。所有受试者均为自愿参加实验，均签署了知情同意书。

1.2 实验方法

rTMS对神经活动的影响效果依赖于其刺激频率，低频rTMS可以抑制神经兴奋性，而高频rTMS则可以增强神经兴奋性。因此，在rTMS用于提高肢体运动能力时，可有两种方式：第一种是通过低频rTMS抑制肢体同侧运动皮层的兴奋性，从而增加肢体对侧运动皮层的兴奋性，促进肢体运动能力的提高；第二种是通过高频rTMS增加肢体同侧运动皮层的兴奋性，促进肢体运动能力的提高。本研究考虑到：一是进行高频rTMS输出时所需的磁场能量较大，其刺激线圈极易发热，影响rTMS设备的使用寿命；二是高频rTMS具有更高的致癫痫可能性；三是本研究的rTMS联合运动训练方法旨在提高肢体的运动能力，未来可用于脑卒中、脑损伤患者。考虑到用于患者时，高频rTMS需要作用的靶点为患侧脑皮层，而脑卒中患者皮层存在损伤，患侧皮层由于脑损伤可能发生解剖上的变化，会在一定程度上影响rTMS的作用效果，因此在本研究中采用了低频1 Hz rTMS的方式。

本研究的rTMS实施使用英国生产的Magstim Rapid2磁刺激器，使用70 mm的八字型线圈。实验前扫描了所有受试者的头部MRI影像，rTMS的实施在Brainsight精密导航下进行，保证刺激靶点的精确性、一致性。rTMS的刺激频率为1 Hz，刺激强度为90%静息运动阈值(resting motor thresholds,RMT)，刺激靶点为优势半球(左半球)初级运动皮层，刺激时间为20 min/次，共1 200个脉冲，5次/周，共两周。

本研究选择了3种非利手不熟悉的运动训练任务，进行非利手的运动训练，每天约1 h，共14 d。翻硬币实验：10个1元硬币和15个一角硬币为一组任务，10 min/d；螺丝螺母实验：非利手持螺母，利手持螺丝，两个螺丝为一组，10 min/d；写英文字母实验：在规定的方格内写英文字母，40 min/d。

Avenanti等的研究表明，先进行rTMS后进行运动训练的rTMS联合运动训练方式使运动技能增强效果更优[5]。因此，本研究采用先低频rTMS抑制优势脑半球，结束后立即开始非优势半球对应的非利手运动训练的方式，以期望通过14 d的rTMS联合运动训练促进非利手运动能力的提高。

1.3 脑电采集

脑电(electroencephalography, EEG)采集使用美国Neuroscan EEG系统和64导Braincap脑电帽，包括62导记录电极、一个地电极及一个参考电极，其中 2个记录电极分别放置眼睛下部和眼外呲处，用于采集垂直方向眼电和水平方向眼电，为后续EEG数据处理时眼电的去除提供数据支持。EEG采集参数设置为DC-200 Hz的滤波，1 kHz采样率。

1.4 实验过程

实验前，首先确定受试者的个体运动阈值和手初级运动皮层靶点。rTMS刺激线圈保持与头皮相切，线圈把柄向后，并与大脑纵裂呈45°。根据解剖学上大脑初级运动皮层的位置，以中央前回的“手结”为中心移动线圈，寻找以最小TMS输出时，10次TMS刺激能产生至少5次肌电运动诱发电位(motor evoked potentials, MEP)幅值大于等于50 μV的皮层位置点，此时的TMS输出强度为该受试者的RMT，该皮层位置点为初级运动皮层。

rTMS联合运动训练的实验流程如图1所示。首先使用九孔柱测试板进行rTMS联合运动训练前的行为学检测，并进行静息态2.5 min EEG采集，然后进行14 d的rTMS联合运动训练，再进行训练后的行为学检测及静息态2.5 min EEG采集。

图1 实验流程Fig.1 Schematic of experimental process

1.5 相位延迟指数

相位延迟指数(PLI)可以用于量化不同脑区间的相互作用[20-21]，是表示脑功能连接性的一种方法。它通过测量两个信号间相位差分布的不对称性，反映某一个信号相位超前或延迟于另一个信号的一致性。相比相干等传统的方法，PLI受参考电极和体积传导的影响较小[22]。如果两个时间序列间的相位差异为ΔΦ(tk) (k=1,2,…,n)，则相位延迟指数可以由下式计算得到，即

PLIi,j=|〈sign[ΔΦ(tk)]〉|

(1)

式中，〈·〉是平均值符号，sign为符号函数。

相位延迟指数的范围在0～1之间，其值为0表示两个信号没有耦合，为1表示相位完全耦合。相位延迟指数值越大，则相位耦合越强。

1.6 加权网络特征

目前，主要有两种方法可以构建无向图：一种是通过对功能连接性矩阵设置阈值将其二值化来构建无权无向图，另外一种是将功能连接性矩阵的值作为连接权重来构建有权无向图。本研究以EEG电极代表脑网络的节点，两两导联信号的PLI值作为连接边的权重构建了有权无向脑网络，探讨rTMS联合运动训练促进运动技能提高的功能连接性及脑网络特征的变化。使用有权重的图论分析是为了避免在进行二值化图论分析时阈值选择的武断性。网络的拓扑特征可以通过一些指标进行评估，其中最常用的评估指标是最短路径长度和节点效率，它可以通过文献中的方法进行计算获得[23]。边的权重定义为PLI的倒数。两个节点最短路径长度为两个节点间最短长度的路径，即节点与节点间经过的边的权重总和。节点的最短路径长度定义为所有节点与该节点间的最短路径长度的平均值，节点效率定义为与该节点相连接的所有节点间最短路径长度倒数的平均值。

1.7 数据处理及统计学分析

使用Matlab及其工具包EEGLAB，对采集的EEG信号进行分析。首先对数据进行预处理，包括变参考为双耳乳突，手动去除干扰大的信号段，降采样到250 Hz，进行[1 Hz,100 Hz]的带通滤波，并使用50 Hz陷波器去除工频干扰，进行独立分量分析，去除眼动分量，获得干净的EEG信号。

选取60 s无伪迹的脑电信号，通过带通滤波提取theta (4～8 Hz)、alpha (8～13 Hz)、beta (13～30 Hz)、gamma1(30～45 Hz)和gamma2(55～100 Hz)频段的EEG信号。通过式(1)计算rTMS联合运动训练前后各频段的PLI，获得了n×n的两两导联的相位同步特征矩阵，本研究共采集了60导联的脑电信号，因此取n=60。然后建立了有权无向脑网络，并计算了节点的最短路径长度和节点效率。对rTMS联合运动训练前后的PLI和脑网络拓扑特征进行了非参数符号秩和检验，P<0.05认为差异具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 行为学的结果

14 d的rTMS联合运动训练前后双手完成九孔柱测试的时间如图2所示。可以看出，rTMS联合运动训练使双手完成九孔柱测试的时间均缩短(左手，前19.1 s± 1.1 s, 后17.5 s±1.4 s；右手，前17.9 s±0.8 s, 后17.6 s±1.6 s)，表明双手灵活性均有所增加。将干预前后的完成时间进行非参数秩和检验，结果显示，rTMS联合运动训练仅使非利手(左手)完成九孔柱测试时间的时间缩短具有统计学意义(P<0.05)，而利手的完成时间缩短没有统计学意义(P>0.05)。

图2 双手完成九孔柱测试的时间Fig.2 The time of nine-hole peg test for hands

2.2 相位延迟指数的结果

为了检测rTMS联合运动训练前后各脑区功能连接性的变化，将全脑60个电极划分为如图3(a)所示左右对称的8个脑区，分别为左右额叶脑功能区、左右中央脑功能区、左右颞叶脑功能区及左右枕叶脑功能区。计算各脑功能区内两两电极之间及脑功能区间两两电极间的PLI，将其叠加平均后获得各脑功能区内和两两脑功能区间的功能连接性。然后将rTMS联合运动训练前后脑功能区内及脑功能区间的功能连接性进行非参数符号秩和检验，将功能连接性具有显著统计学变化的两两脑功能区使用直线连接起来，脑功能内具有显著统计学变化的区域使用实体方块表示，红线代表显著增加，蓝线和蓝块代表显著降低，计算结果如图3(b)～(f)所示。

由图3(b)～(f)可以看出，rTMS联合运动训练对脑功能连接性的影响主要表现在脑功能区间，对脑功能区内的影响较小。另外，结果还可以发现，rTMS联合运动训练对EEG不同频段的影响均不相同，使低频段(theta、alpha)的功能连接性增强，使高频段(beta, gamma1和gamma2)的功能连接性减弱，对alpha频段的影响最为显著，特别地，使alpha频段非优势侧中央脑区与优势侧额叶脑区(before：0.141 4±0.102 5；after：0.217 2±0.134 7；P<0.05)、非优势侧额叶脑区(before：0.141 0±0.109 9；after：0.205 9±0.136 1；P<0.05)的功能连接性显著增加。另外，显著增加了theta频段优势半球中央区与双侧额叶之间、优势半球额叶与颞叶之间的连接(P<0.05)，显著降低了beta和gamma1频段优势半球中央区域颞叶区间的功能连接性，降低了gamma2频段非优势半球中央区与双侧颞叶区间的功能连接性(P<0.05)。

图3 rTMS联合运动训练前后具有显著性差异的脑区间连接 (P<0.05)。(a)全头电极的脑区划分；(b)Theta频段；(c)Alpha频段；(d)Beta频段；(e)Gamma1频段；(f)Gamma2频段Fig.3 Significantly changes of functional connectivity induced by rTMS combined with motor training (P<0.05). (a)A schematic diagram of partition for all electrodes; (b)Theta band; (c)Alpha band; (d)Beta band; (e)Gamma1 band; (f)Gamma2 band

2.3 网络特征

为了评估rTMS联合运动训练对脑网络拓扑特征的影响，计算了各频段脑网络节点的最短路径长度和节点效率，结果如图4、5所示。可以看出，rTMS联合运动训练对各频段脑网络特征的影响并不相同，使低频段(theta和alpha)的节点最短路径长度降低、节点效率增加，使高频段(beta,gamma1和gamma2)的节点最短路径长度增加、节点效率降低。

图4 rTMS联合运动训练前后节点最短路径长度的变化。(a)Theta频段；(b)Alpha频段；(c)Beta频段；(d)Gamma1频段；(e)Gamma2频段Fig.4 The changes of the shortest path length induced rTMS combined with motor training. (a)Theta band; (b)Alpha band; (c)Beta band; (d)Gamma1 band; (e)Gamma2 band

图5 rTMS联合运动训练前后节点效率的变化。(a)Theta频段；(b)Alpha频段；(c)Beta频段；(d)Gamma1频段；(e)Gamma2频段Fig.5 The Changes of the node efficiency induced rTMS combined with motor training. (a)Theta band; (b)Alpha band; (c)Beta band; (d)Gamma1 band; (e)Gamma2 band

经过非参数符号秩和检验后显示，gamma2频段在双侧中央区节点效率(左中央区，before：0.060 0±0.000 3；after：0.042 9±0.001 3；P<0.05；右中央区，before：0.060 7±0.002 3；after：0.041 9±0.002 4；P<0.05)和最短路径长度(左中央区，before：18.539 0±0.457 1；after：28.585 8±1.001 4；P<0.05；右中央区，before：18.650 8±0.438 6；after：28.853 0±1.652 6；P<0.05)发生了显著性的改变。另外，rTMS联合运动训练使beta频段优势半球中央区最短路径长度显著增加(P<0.05)。

3 讨论

本研究使用低频1 Hz rTMS刺激优势半球运动区，抑制优势半球的脑活动，而非优势半球对应的非利手进行不熟悉的运动训练，经过14 d后，达到了非利手运动能力提高的效果(见图2)。使用PLI方法建立了有权无向脑网络，计算了脑网络的节点最短路径长度和节点效率的变化，探讨了14 d和rTMS联合运动训练对脑功能连接性及网络拓扑特征的影响。

研究结果表明，rTMS联合运动训练主要影响脑功能区间的连接性，对脑功能区内连接性的影响较小(见图3)，提示rTMS联合运动训练调控了脑功能区间的信息交互作用，对脑功能区内的信息交互作用影响较小。本研究采用的3种运动训练均为复杂的运动形式，在执行运动训练任务时，涉及了空间方向的定位、运动的计划及执行等多个与运动相关的环节。在已知的脑区所对应的脑功能认知中，后顶叶皮层负责获悉身体与外部环境相对位置信息的技能，前额叶皮层、前运动区和辅助运动区参与运动计划的实施过程，向初级运动皮层发出信息，初级运动皮层产生的兴奋通过皮质脊髓束传导到外周肌肉，从而产生运动[24]。这些涉及运动环路的很多脑区均属不同的脑功能区，因此提示rTMS联合运动训练对运动技能的改善更多是改变了脑功能区间的信息传输能力。

研究结果还发现，rTMS联合运动训练使低频段(theta和alpha)的功能连接性增加，高频段(beta和gamma)的功能连接性降低(见图3)。特别地，rTMS联合运动训练对alpha频段的非优势半球中央脑区的连接影响最显著。alpha频段作为闭目静息态的主要振荡节律，可以预测执行运动任务时神经认知-运动进程的效率[25]；中央脑区位于运动区，与额叶等脑区连接的增强与运动能力的提高密切相关[16-18]。因此，研究结果提示，rTMS联合运动训练可能是通过增强静息态主要振荡节律alpha节律的非优势半球中央脑区的连接来增强肢体的运动能力的。此外，对节点的网络拓扑分析表明，rTMS联合运动训练降低了高频段gamma2的脑区信息传输能力(见图4、5)。高频神经振荡与运动行为的认知功能相关[26]，说明rTMS联合运动训练可能使与运动相关认知功能的效率降低。可能是经过14 d的rTMS联合运动训练后大脑的运动认知能力得到了提高，所以仅用较低的效率就可完成复杂的运动认知活动。总之，本研究的结果表明，rTMS联合运动训练可能是通过增强闭目静息态的主要振荡节律的脑区间信息传输，降低运动所需的认知调动，从而增强肢体的运动能力。

样本数量较小和缺乏对照组是本研究的局限性之一(10名受试者)。未来需要招募更多受试者和(或)多个对照组，以更好地理解rTMS联合运动训练诱发的运动技能改善中的脑活动调控，如招募单纯rTMS或运动训练的对照组。另外，在本研究中所有受试者均为男性，因此不能说明性别对结果的影响。未来为了更全面地评估rTMS联合运动训练对脑活动的作用，需要招募与之匹配的女性受试者。最后，本研究仅探讨了rTMS联合运动训练对静息态脑网络的影响，未来将着重分析单脉冲TMS刺激时脑活动的变化，特别是非优势半球运动区，促进对rTMS联合运动训练、提高运动能力的脑机制的理解。尽管存在以上限制，但本研究的结果仍在一定程度上表明了rTMS联合运动训练对静息态神经网络的影响，对理解运动技能提高的脑机制具有一定的帮助。

4 结论

rTMS联合运动训练可以提高肢体的运动能力，本研究使用脑网络分析方法，探讨了rTMS联合运动训练对脑活动的影响。结果表明，rTMS联合运动训练主要调控了脑功能区间，使低频段EEG脑区间的信号传输效率增加，高频段的信号传输效率降低。通过rTMS联合运动训练对脑活动影响机制的初步探讨，加深了对rTMS联合运动训练作用的理解，为以后应用于脑卒中、脑损伤患者的肢体运动功能康复提供了前期的实验数据。