从苹果皮中提取和分离熊果酸研究

范何宸锐 邹桂英

摘要：以苹果（Malus pumila Mill.）皮为原料，以NaOH的乙醇水溶液为溶剂进行超声辅助提取，并采用响应面的方法对提取条件进行优化，提取液体经浓缩，加盐酸调节pH 3.0，过滤，用10%的乙醇水溶液洗涤滤饼、滤饼经干燥、石油醚脱脂、乙醇结晶和重结晶后，可得到高纯度的熊果酸晶体。该工艺所用设备和原料易得，方法简单，易于实现工业化生产，通过该方法可使苹果皮变废为宝，减少环境污染。

关键词：苹果（Malus pumila Mill.）皮；熊果酸；提取；分离

中图分类号：S661.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0079-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.019

Abstract： Apple（Malus pumila Mill.） peel was extracted with ultrasound assistance using ethanol aqueous solution containing NaOH as extracting solvent， the extraction conditions were optimized by response surface method. The extract was concentrated， and its pH was justified to 3.0 with hydrochloric acid. The mixture was filtrated and filter cake was washed with 10% ethanol aqueous solution. The filter cake was dried， and then degreased by petroleum ether. The residue was crystallized and recrystallized in ethanol to obtain ursolic acid crystal. This method was very simple and easy to scale up， which can make apple peel valuable and can reduce environmental pollution.

Key words： Apple（Malus pumila Mill.） peel； ursolic acid； extraction； separation

苹果（Malus pumila Mill.）的生产和消费近年来持续增长，已成为全球产量第二的水果。据统计，2016年中国苹果产量约为4 380万t[1]，是世界最大的苹果生产国和消费国，占世界产量的40%左右[2]，其中约30%用于工业加工，主要用于生产苹果汁和果脯等。在日常消费和加工苹果时，会产生大量的苹果皮。如按果皮占果重1%計算，每年中国苹果加工厂将产生13.14万t的苹果皮，如此数量惊人的苹果皮如果不处理好，将产生严重的环境污染问题[1，2]。苹果皮中含有丰富的营养成分，如膳食纤维、单糖、蛋白质等，可被用作饲料、栽培蘑菇和发酵酒精等。除此之外，苹果皮还含有重要的生物活性分子，如果胶、多酚、黄酮和五环三萜类化合物[3-6]，特别是其中的五环三萜类化合物，因其具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤的作用，引起人们的重视[7，8]。熊果酸（Ursolic acid）是苹果皮中含量最丰富的五环三萜类化合物，结构如图1所示，因为它具有突出的生物活性和药用价值，近年来成为研究热点[7，9，10]。

本研究以含氢氧化钠的乙醇水溶液为提取溶剂，通过超声波辅助提取的方法快速从苹果皮中提取熊果酸，再利用盐酸调pH、过滤、洗涤、干燥、脱脂和结晶的方法得到高纯度的熊果酸晶体，工艺流程如图2所示，该方法所用试剂价廉易得、工艺简单，以期为苹果皮熊果酸提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果购于超市，用削皮刀削皮，苹果皮干燥并粉碎，过40目筛，备用。

熊果酸标准品购自南京泽朗医药科技有限公司；色谱级的甲醇购自西陇科学股份有限公司；二次去离子水，实验室自制。其余试剂皆为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent仪器有限公司）；KQ-600DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GS12-B电子恒速搅拌器（上海安亭电子仪器厂）；SHZ-ⅢB循环水式真空泵（临海市谭氏真空设备有限公司）；RES2CS-2旋转蒸发器、W201B4恒温浴锅（上海申生科技有限公司）；电热恒温水浴锅（上海东星建材试验设备有限公司）；FZ102微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BAS124S分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.3 熊果酸的提取

将干燥的苹果皮粉碎后过筛，收集20～40目的粉末，干燥备用。精密称取一定量的苹果皮粉末，加入一定量的含NaOH的乙醇水溶液，称量，在200 W功率下超声辅助提取0.5 h，擦干外壁，再称量，用乙醇补充缺失的质量，离心。用注射器抽取一定量上清液，过0.45 μm滤膜进行检测。熊果酸的提取率按以下公式计算。

选取液固比（A）（mL∶g，下同）、乙醇体积分数（B）、NaOH与苹果皮质量比（C）作为优化因素，按表1所示，采用三因素三水平Box-Behnken试验设计，对超声辅助提取苹果皮中熊果酸的工艺条件进行优化，具体条件组合及对应提取率如表2所示。

1.4 苹果皮中熊果酸分离方法

按图2所示的工艺流程从苹果皮中分离熊果酸，各步骤所得样品中熊果酸的纯度，可用样品中所含熊果酸的质量百分比表达，计算方法按以下公式进行。

1.5 样品中熊果酸的测定

根据参考文献[11]，采用HPLC方法进行熊果酸含量的测定，以Sepax Bio-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，柱温30 ℃，以乙腈水溶液（体积比，乙腈∶0.1%磷酸水溶液=90∶10）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化从苹果皮中提取熊果酸

根据表2中的试验方案和结果，利用Design-Expert软件对表2 试验数据进行分析和回归，采用二次多项式逐步回归拟合，得到的拟合模型：Y=13.549 5+0.035 65×A-31.692 5×B-10.625×C-1.75×10-3×A×B-0.482 5×A×C+10.25×B×C-3.012 5×10-4×A2+18.437 5×B2+238.75×C2。根据这个回归模型的结果进行方差分析，结果如表3所示。

模型的F值为11.28，说明模型极显著，模型的F值只有0.21%的机率是由试验噪音引起的。模型的Prob>F（0.002 1）小于0.05，说明所用模型是极显著。失拟项值（3.56）是不显著的，说明所用模型可用于试验数据的拟合。在数学模型中，只有A和B2为显著项，故在保证模型多层次性的前提下，剔除模型中不显著项，对模型进行缩减得到Y=13.487 48+0.022 113×A-31.514 72×B+5.250 00×C-0.482 5×A×C+18.402 78×B2。根据这个缩减后的回归模型的结果进行方差分析，结果如表4所示。

模型的F值为24.89，说明模型极显著，模型的F值只有0.01%的机率是由试验噪音引起的。模型的Prob>F（<0.000 1）远小于0.05，这也说明所用模型极显著。失拟项值（2.07）是不显著的，说明该模型可以用于试验数据的拟合。在数学模型中，只有A、C和B2为显著项，AC项较为显著，B为不显著项，但为保证模型的多层次性，在模型中仍然保留B项。

由图3可知，A项与C项的交互作用较弱。根据缩减后的数学模型，利用Design-Expert 软件优化得到最佳的理论提取条件：液固比29.75，乙醇体积分数0.75%，NaOH与原料质量比0.005，此条件下理论计算的提取率为0.802%。根据理论计算条件，对试验条件进行修正，为液固比30.00，乙醇体积分数0.75%，NaOH与原料质量比0.005，依据此条件，重复3次验证试验，得到熊果酸平均提取率为0.78%，与理论计算提取率很接近。

2.2 苹果皮中熊果酸的分离提取

从苹果中分离提取熊果酸的试验步骤如图2所示。按上述优化后的提取条件，取50 g苹果皮粉末，加入1 500 mL体积分数为75%乙醇和0.25 g NaOH，搅拌，超声辅助提取，抽滤，收集滤液；滤渣按前述方法再提取2次，合并3次的滤液后，提取液浓缩至100 mL；向浓缩液中慢慢加入盐酸，调pH=3.0，静置过夜，抽滤，滤饼用100 mL 10%的乙醇溶液洗涤，烘干得粗产品2.1 g。粗产品用石油醚浸泡，过滤后，取滤饼，干燥后得到熊果酸粗品1.6 g。用52 mL无水乙醇在70 ℃左右搅拌至粗品完全溶解，快速过滤，滤液在室温下密封静置冷却，缓慢结晶。所得晶体，呈细针状，过滤，得到熊果酸晶体0.425 7 g。再用无水乙醇重结晶得到高纯度熊果酸针状晶体0.22 g。如图4表示，苹果皮通过多个步骤的提取和分离过程，成功制备得到无色针状的熊果酸晶体。对于不同提取和分离阶段得到的样品，采用HPLC的方法对产品中所含熊果酸的含量进行了测定。

图5为各样品的高效液相色谱图。由图5可知，样品随分离过程的进行，熊果酸峰面积所占比例逐渐提高，说明样品中熊果酸的含量逐渐上升。通过计算发现，在经石油醚浸泡后的粗品、经10%乙醇溶液洗后的粗品、经第一次重结晶和经第二次重结晶得到的熊果酸晶体中熊果酸的含量分别为64.37%、69.05%、75.14%和99.09%。由此發现，该分离方法非常有效，样品中熊果酸的含量逐渐提高，最终得到高纯度的熊果酸晶体。

3 结论

以苹果皮为原料，通过提取、脱脂、洗涤、结晶和重结晶后，得到高纯度的熊果酸晶体，该工艺所用设备和原料易得，方法非常简单，所以易于实现工业化生产。另外，通过该方法使苹果皮变废为宝，并且可减少乱扔苹果皮引起的环境污染。

参考文献：

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