药桑叶多糖的体外抗氧化活性研究

何新苗， 孟 磊， 李 欣， 孙 莲， 马晓丽

(1新疆乌鲁木齐市第一人民医院， 乌鲁木齐 830002； 2新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

桑叶，为桑科植物桑(MorusalbaL)的干燥叶，首载于《神农本草经》[1-2]，药理学研究表明其具有降血糖、降血脂、抗凝血等作用，是一种珍贵的药食两用资源[3]。药桑在植物分类学上属于桑科黑桑种(MorusnigraLinn．)，也是我国唯一的黑桑种，其营养价值极为丰富。

药桑叶中的主要活性成分包括黄酮、生物碱、植物甾醇及多糖等[4-6]，孙莲等[7]对新疆不同地区药桑叶中的多糖进行提取，发现不同地区含量存在一定差异。植物多糖是近年来的研究热点，药理活性研究也证明桑叶多糖具有显著的降血糖作用[8]，有文献报道桑叶多糖对四氧嘧啶致糖尿病大鼠具有治疗效果[9],认为其调节糖脂代谢可能与其改善氧化应激有关。因此有必要对新疆药桑叶多糖及其体外试验进行深入系统的研究,为新疆桑资源在抗氧化功能方面的食品开发以及其体内抗氧化研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1材料桑叶采自新疆喀什，经新疆医科大学药学院天然药物教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为桑科(MorusablaL.)的干燥叶。

1.2仪器与试剂紫外可见分光光度计UV-2550 (日本，岛津),红外光谱仪IR-Prestige21(日本，岛津)，电子恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂)，电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)，电子天平(梅特勒)，旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，酸度计(上海雷磁)。

药桑粗多糖(实验室自制)，DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基)(SIGMA-ALORICH)，ABTS(2, 2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二胺盐)、邻二氮菲、三羟甲基氨基甲烷(trisbase)、邻苯三酚、抗坏血酸(维生素C)、K2S2O8、甲醇等试剂均为分析纯(天津市致远化学试剂有限公司)，娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)。

1.3药桑叶多糖的提取及含量测定

1.3.1 粗多糖的提取

1.3.2 多糖含量测定—苯酚硫酸法[10]精密称取无水葡萄糖置100 mL的容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，超声溶解得浓度为1.00 mg/mL的贮备液，于4℃冰箱中保存。分别取上述葡萄糖溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至25 mL的具塞试管中，用蒸馏水补足至2.0 mL，再加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，然后迅速加入5.0 mL的浓硫酸溶液，摇匀，放置30 min后，以零管作空白，立即于490 nm读数。以吸光度值(A)为纵坐标(Y)，以葡萄糖的浓度(C)为横坐标(X)，绘制标准曲线。

粗多糖含量的测定：称取药桑叶粗多糖0.01 g，用蒸馏水定容于 100 mL容量瓶，吸取 1.0 mL多糖液，加入纯水补足2.0 mL，再加入1.0 mL 6 %苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸，充分震摇后冷却显色。在 490 nm 紫外分光光度计测定吸光度值。根据标准曲线计算药桑叶中糖的质量浓度，计算多糖得率。

多糖的得率公式(%)=C·n·V/W×100%

式中： C一标准曲线多糖的浓度(mg/mL)

n一稀释倍数

V一配成溶液体积(mL)

W一药桑叶质量(g)

1.3.3 药桑叶粗多糖的红外鉴定 药桑叶粗多糖的红外光谱测定在傅里叶红外光谱仪(IR-Prestige21)的中红外区进行，取1.5 mg经干燥的多糖样品，与同样条件下干燥过的100～200 mg KBr粉末在玛瑙研钵中轻轻研磨均匀，经压片机压成薄片，于4 000～600 cm-1红外波长范围下测定。

1.4桑叶粗多糖的体外抗氧化活性

1.4.1 二苯代苦味酰基(DPPH·)自由基清除率试验 参考文献 [11]的方法，分别配制各个不同浓度的样品溶液以及维生素C(VC) 的样品溶液，桑叶多糖和VC的浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL；同时配制0.004%的DPPH·甲醇溶液。

精密量取4.0 mL 0.004% DPPH·甲醇溶液至不同的具塞试管中，再分别加入 1.0 mL各浓度的样品溶液，30 min 室温避光处理后用紫外可见分光光度计测定,于516 nm 处立刻读取吸光度Ai。VC作对照。按下列公式计算各样品对 DPPH·自由基的清除率。

DPPH·自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%

式中，A0表示(DPPH+试样溶剂)均匀混合后的吸光度;Ai表示(DPPH+供试品溶液)均匀反应后的吸光度；Aj为样品与溶剂的空白吸光度。

1.4.2 二铵盐自由基(ABTS·)清除率试验 参考文献[12]方法，采用乙醇稀释将 ABTS溶液在 30℃、734 nm 波长条件下的吸光度控制为(0.70±0.02)，即为工作液。精密量取 0.5 mL不同浓度的样品溶液加入试管中，与15.0 mL 的 ABTS工作液混匀，室温静置并于暗处反应 6 min， 734 nm 处测吸光值为Ai。严格按下列公式计算各样品对ABTS·自由基的清除率。

ABTS·自由基清除率(%)=[1-Ai/Ab]×100%

上式中Ai为加入供试品溶液后吸光值； Ab加入蒸馏水时吸光值。

1.4.3 羟自由基(·OH)清除率试验 参考文献[13]方法。分别取不同浓度的多糖溶液1.0 mL，依次加入1.0 mL 0.75 mM邻菲罗啉乙醇溶液，1.0 mL 0.75 mM FeSO4溶液，1.0 mL 0.01% H2O2溶液，2.0 mL PBS缓冲液(pH=7.4)，混匀后在37℃水浴1 h,立刻在512 nm波长处测吸光度值Ai，VC作对照。按下列公式计算各供试品溶液对羟自由基的清除率。

·OH自由基清除率(%)=(Ai-A0)/(Aj-A0)×100%

上式中Ai为加入样品反应后溶液的吸光值；相同条件下，1 mL去离子水代替多糖溶液，其他溶液如样品组，所测吸光度值即为A0；相同条件下，去离子水代替H2O2测定吸光度值记为Aj。

清除率(%)=(△A1/△t-△A2/△t)/(△A1/△t)×100

式中：△A1/△t为邻苯三酚自氧化时反应速率；△A2/△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

2 结果与分析

2.1药桑叶多糖含量以吸光度值(A)为纵坐标(Y),以标准品浓度(C)为横坐标(X)，绘制标准曲线，标准曲线回归方程为Y=18.95X-0.100 9(X为葡萄糖质量浓度，A为吸光度)，R2=0.994 3，线性关系良好。根据标准曲线计算药桑叶多糖提取率。代入多糖的得率计算公式(%)=C·n·V/W×100%，最终药桑叶多糖的含量为3.85%,见图1。

2.2药桑叶多糖的红外光谱分析桑叶多糖具有典型的糖特征吸收峰，在3 600～3 200 cm-1区段中，3 387 cm-1处为-OH伸缩振动，在3 000～2 800 cm-1区段中，2 927 cm-1为甲基、亚甲基的伸缩振动峰，在2 800～1 200 cm-1区段中，1 639 cm-1处的峰显示该多糖中存在酰胺基，在1 410～1 200 cm-1区段中，1 410 cm-1为C-H的变角振动，在1 200～800 cm-1区段中，891 cm-1处的吸收峰表明多糖结构中存在β型-吡喃糖苷键(图2)。

图1 葡萄糖标准曲线

图2 桑叶多糖的红外光谱

2.3药桑叶多糖清除DPPH·的能力DPPH·自由基是一种氮族自由基，因其易与具有氢键供体的化合物发生电子转移反应而被广泛应用于抗氧化研究中，在所选质量浓度范围内，随着多糖质量浓度的增加，清除效果是增强的，不同浓度的样品对 DPPH 自由基的清除能力呈现良好的量效关系(图3)。在浓度为1.2 mg/mL时，清除率达21.77%,这表明药桑叶具有清除 DPPH自由基的能力，清除效果不及VC。钟耀广等[15]报道香菇多糖未脱蛋白的粗多糖也具有抗氧化活性，本次试验也证明药桑叶粗多糖同样具有抗氧化活性。

图3 DPPH·的清除曲线

2.4药桑叶多糖对ABTS的清除能力ABTS自由基阳离子清除实验是ABTS自由基阳离子的清除能力评价依据为不同浓度受试物对ABTS自由基阳离子溶液吸光度的影响，该方法最早由Miller提出[16]，随时间加工被广泛用于天然药物活性测试尤其是抗氧化活性(图4)。在一定质量浓度范围内桑叶多糖对ABTS自由基具有一定的清除作用，虽较维生素C弱，但清除率亦随着多糖浓度的增加而上升，呈现一定量效关系，在浓度为1.2 mg/mL时，清除率达到25.16%。

图4 对ABTS的清除曲线

2.5桑叶多糖对羟自由基(·OH)的清除能力羟自由基(OH-)作为生物体细胞内反应活性最为强烈的氧族自由基，是在超氧阴离子和过氧化氢被金属离子催化作用产生。待评价物质中的抗氧化物质可以竞争捕捉体系中的羟自由基，因此，该法也是评价天然植物多糖抗氧化活性的重要组成部分。药桑叶多糖随着多糖质量浓度的增大，对羟自由基的清除作用也随之增强，同时具有较强的清除羟基自由基的能力，清除效果与VC接近(图5)；在浓度为1.2 mg/mL时，清除率达到91.3%，这说明粗多糖的羟基基团能够提供氢电子与羟基反应是起到清除羟基自由基的作用关键。

图5 对羟自由基的清除曲线

由图6可见，药桑叶多糖对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基(O2) 的清除率一直处于较高水平,与维生素C相近，在质量浓度为1.2 mg/mL时，清除率可以达到85.94%，说明药桑叶多糖具有较好的抗氧化活性。

图6 超氧阴离子自由基清除能力

3 结论

本试验采用传统的水煎法提取药桑叶粗多糖并测定多糖的得率为3.85%，红外光谱对粗多糖的鉴定同样显示了多糖特征官能团相关的谱峰，进一步验证了本次试验提取得到的多糖样品。

在体外抗氧化活性检测方面，试验采用了四种不同的自由基进行抗氧化能力试验，比较全面、真实地了解了药桑叶多糖具有超强抗氧化的功能。试验结果表明，桑叶多糖对不同的自由基包括生物体细胞内反应活性最为强烈的氧族自由基的清除能力是不同的，在一定的质量浓度范围内均呈现剂量依赖的关系，虽然在DPPH自由基试验和ABTS自由基试验中发现抗氧化活性均远较 V C弱 ，但在一定浓度范围下，抗羟自由基和超氧阴离子自由基试验中展现了良好的抗氧化性能，说明药桑叶多糖具有抑制自由基生成的作用，可以作为自由基清除型抗氧剂应用；另外，由于本次试验采用粗多糖进行，粗多糖中可能含有各种不同级份的多糖，因此需要进一步试验将粗多糖进行纯化，并说明每一级份多糖的单糖组成，再结合体内体外试验全面说明其抗氧化作用或者不同级份多糖的抗氧化能力大小，为高效开发药桑叶多糖功能食品及药品提供参考。