城市污泥腐殖土中活性物质分离及作用机理研究

丁　伟，牟鹏举，Muhammad Shahid Khan,2

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨　150030；2.白沙瓦农业大学植物保护系，巴基斯坦　白沙瓦　1599107）

城市生活污泥是污水处理过程中的沉积物，含有重金属、病原微生物和有机污染物等有害物质，对环境产生不利影响[1-2]。我国城市生活污泥产量日益增多，处理方式成为关注热点[3]。

目前世界各国对污泥处理主要有3种方式：卫生填埋、焚烧和农业再利用。卫生填埋是处理生活污泥普遍方法并被多数国家采用，然而此方法占地面积大且对地下水造成污染[4]。随农业技术进步，发达国家如美国、英国等城市生活污泥填埋比例不断下降，污泥用于农业再利用增加[5]。与国外发达国家较高的污泥农用率相比，我国污泥农用率较低，卫生填埋仍是处理污泥主要途径[6-8]。城市生活污泥富含有机质、氮、磷及微量元素等农作物生长必需营养成分[9]，经处理后城市生活污泥可用于在园林绿化和药用植物栽培[10-11]。探索城市污泥再利用并降低环境危害，是解决污泥问题重要途径[12-13]。

本文所用城市污泥腐殖土来自哈尔滨市，污泥经腐熟制成的腐殖土是良好肥料和土壤改良剂[14]，但由于污泥腐殖土严重抑制作物种子萌发，限制腐殖土应用。因此，分离并鉴定该腐殖土中活性抑制物质对合理利用城市生活污泥具有重要意义。本文采用蒸馏水浸提法提取污泥腐殖土中粗物质，再经硅胶柱分离和红外光谱鉴定粗提物抑制种子萌发活性物质，为哈尔滨地区污泥合理利用提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

2016年4月开始试验，城市污泥腐殖土由龙江环保集团提供，试验仪器：便携式红外分析器，GXH-3010D，北京市电脑技术应用研究所；色谱柱，SE-54，日本岛津公司；旋转蒸发仪，RE-52AA，上海申胜生物技术有限公司；循环水式真空泵，SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司。

1.2　方法

1.2.1城市污泥腐殖土活性物质粗提取

城市污泥腐殖土活性物质粗提物采用蒸馏水浸提法并用超声波震荡提高提取效率[15]，称量腐殖土200 g于1 L容量瓶并加入800 mL蒸馏水，20℃，20 kHz充分震荡1 h后0.22 μm超滤膜过滤，滤液经1 ku透析袋透析72 h后收集粗提物，置于0℃冰箱备用。

1.2.2城市污泥腐殖土粗提物对种子萌发影响测定方法

种子萌发试验采用培养皿法，25℃培养箱中培养[16]。选取均一水萝卜、小白菜及油菜种子，2%次氯酸钠溶液消毒种子，清水冲洗3次。设6个处理，3次重复，每个铺有双层湿润滤纸培养皿中放入50粒供试种子，每个处理各倒入20 mL供试溶液（见表1）。调查不同时间种子发芽数，计算各处理种子发芽率。

表1　供试腐殖土活性粗提物浓度Table 1　Solution concentration of substances in humus soil

1.2.3城市污泥腐殖土粗提物对植物抗逆酶影响

供试植物为玉米，选择种子萌发试验中抑制种子萌发作用较强浓度喷施茎叶[17]，5次重复。选颗粒饱满、尺寸一致玉米种子，经消毒、浸种处理后播种于直径9 cm塑料营养钵。出苗后第10天，按每平方米面积50 mL污泥活性物质溶液茎叶喷雾处理，以清水为对照，施药后7、14、21 d测定玉米生长指标及抗氧化酶活性。

1.2.3.1超氧化物歧化酶（SOD）活性测定

酶液提取：称取玉米第一片叶0.5 g置于预冷研钵中，加2 mL预冷pH 7.8磷酸缓冲液，加入少量石英砂研磨匀浆，缓冲液定容至终体积8 mL，4℃7 000 r·min-1离心20 min，上清液即为SOD粗提液。

活性测定：酶活性测定采用分光光度比色法，以抑制NBT光化还原反应50%为1个超氧化物酶活力单位（U）[18]。

1.2.3.2过氧化物酶（POD）活性测定

酶液提取：取0.5 g待测叶片放入研钵中，加入pH 5.5磷酸缓冲溶液5 mL，研磨匀浆，4℃8 000 r·min-1离心15 min，上清液即为过氧化物酶粗提液。

活性测定：过氧化物酶活性测定采用分光光度比色法，以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）[18]。

1.2.3.3过氧化氢酶（CAT）活性测定

酶液提取：称取玉米叶片样品0.5 g，加入pH 7.8磷酸缓冲溶液5 mL，研磨匀浆，转移到离心管中，定容到8 mL。4 ℃ 4 000 r·min-1离心15 min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

活性测定：过氧化氢酶活性测定采用分光光度比色法，以每分钟A240吸光度值减少0.01为1个酶活性单位（U）[18]。

1.2.3.4苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定

酶液提取：称取玉米叶片样品0.5 g，加入少量石英砂，吸取4 mL硼酸缓冲液（pH 8.8，含5 mmol·L-1巯基乙醇），于研钵中磨匀浆，转移至离心管中，以硼酸缓冲液稀释到8 mL，10 000 r·min-1离心15 min，取出置于冰水浴中，上清液供测定酶活使用。

活性测定：苯丙氨酸解氨酶活性测定采用分光光度比色法，以每分钟A290吸光度值变化0.01为1个酶活单位（U）[19]。

1.2.3.5肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）活性测定

酶液提取：称取玉米叶片样品0.5 g，加入提取液研磨匀浆后移到离心管中，稀释到8 mL。提取液组成为：pH 8.9 50 mmo·L-1Tris-HCl，15 mmo·L-1β-巯基乙醇，4 mmo∙L-1MgCl2，5 mmo·L-1VC，10 μmol∙L-1Leupeptin 亮肽素，1 mmo·L-1PMSF，0.15%PVP（W/V），10%甘油。4℃ 10 000 r·min-1离心20 min。取上清液为C4H粗酶提取液。

活性测定：肉桂酸-4-羟基化酶活性测定采用分光光度比色法。以每分钟A340吸光度值变化0.01为一个酶活性单位（U）[19]。

1.2.3.64-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）活性测定

酶液提取：称取玉米叶片样品0.5 g，加入提取液研磨匀浆后转移到离心管中，稀释到6 mL。提取液组成为：pH 8.9 50 mmo·L-1Tris-HCl，15 mmo∙L-1β-巯基乙醇，4 mmo∙L-1MgCl2，5 mmo∙L-1VC，10 μmol·L-1Leupeptin 亮肽素，1 mmo·L-1PMSF，0.15%PVP（W/V），10%甘油。4℃ 10 000 r·min-1离心20 min。取上清液为4CL粗酶提取液。

活性测定：4-香豆酸-辅酶A连接酶活性测定采用分光光度比色法。以每分钟A333吸光度值变化0.0001为一个酶活性单位（U）[19]。

1.2.4城市污泥腐殖土活性物质分离与鉴定

2.3 g城市污泥腐殖土粗提物研磨成粉并置于200 mL蒸馏水中，完全溶解后加入80～100目硅胶5 g。粗提取物与硅胶混合均匀后60℃水浴搅拌，蒸发水分至15%，置于干燥器内冷却至室温后得样品硅胶。称150 g 200～300硅胶作分离胶，然后把干燥样品胶加入柱内，顶部置一层薄脱脂棉，3倍柱体积蒸馏水打通硅胶柱。薄层层析法（TLC）选择洗脱剂，硅胶板以硅胶254为载体选择不同洗脱溶剂，供试洗脱剂分别为：乙酸乙酯-乙醇-水，正丁醇-酒精-水，正丁醇-醋酸-水，根据TLC的Rf值选择洗脱液，以正丁醇-酒精-水为展开剂洗脱[20-21]。经反复试验确定正丁醇∶酒精∶水为9∶1∶1，每15 mL收集一份洗脱液。薄层展开后254 nm紫外灯光照确定斑点位置，计算比移值Rf，合并相同馏分并对馏分作活性跟踪试验。干物质中活性物质经红外光谱检测后结合官能团红外吸收特征频率表，确定化合物结构。

1.2.5城市污泥腐殖土活性物质作用机理测试方法

供试种子为水稻，分离获得活性物质处理种子，淀粉酶含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法[22]。

2　结果与分析

2.1　城市污泥腐殖土粗提物对种子萌发影响

城市污泥腐殖土粗提物处理水萝卜种子，发芽率受明显抑制。36 h内，200倍和400倍液处理种子萌发率分别为43.34%和57.34%，600倍液液以上种子发芽率较高，达88.66%～96.66%，72 h后发芽率与对照比无明显差异，而200倍液处理下种子发芽率仅为57.34%，仍受显著抑制，结果如表2所示。

表2　提取物对水萝卜发芽率影响Table 2　Effect of extract on the germination rate of radish （%）

小白菜发芽试验表明，200倍和400倍液下种子发芽率72 h内均显著降低，36 h内发芽率分别为50.7%和63.3%，说明种子发芽势也受显著影响。600至1 000倍浓度条件下，48 h种子发芽率达83.3%以上，72 h发芽率达90%以上。随粗提物稀释倍数增高，小白菜种子发芽率增高，但200～400倍液浓度下，种子发芽势受显著抑制，其中以200倍液处理种子发芽率最低，结果如表3所示。

油菜种子发芽试验表明，经粗提物处理油菜种子，发芽率明显受到抑制。36 h内200倍和400倍液处理种子，其发芽率分别为57.7%和63.3%，除对照组外，其他浓度处理组发芽率达80%以上。72 h后除200倍液外发芽率均90%以上。随粗提物稀释倍数增高，油菜种子发芽率增高，其中以200倍液处理种子发芽率最低，抑制效果最显著，结果如表4所示。

表3　提取物对小白菜发芽率影响Table 3　Effect of extracts on the germination rate of Chinese cabbage （%）

表4　提取物对油菜发芽率影响Table 4　Effect of extracts on the germination rate of rape （%）

2.2　城市污泥腐殖土粗提物对植物超氧物歧化酶（SOD）活性影响

200倍和400倍粗提液处理玉米植株SOD活性显著高于对照，200倍液SOD在施药后第14天达最高值后开始降低。400倍液处理SOD变化与对照规律一致，表现为先降后升，但SOD活性始终显著高于对照，结果如图1所示。

2.3　城市污泥腐殖土粗提物对植物过氧化物酶（POD）活性影响

粗提物200倍液和400倍液处理后玉米幼苗中POD活性均显著提高，且峰值出现在施药后第14天，酶活性分别较对照高32.86%和28.03%。14 d至21 d植株中POD活性虽然一定程度降低，但仍明显高于对照。表明随粗提物浓度升高，玉米幼苗中POD活性升高，以200倍液对玉米植株POD活性抑制作用最大，结果如图2所示。

2.4　城市污泥腐殖土粗提物对植物过氧化氢酶（CAT）活性影响

粗提物200倍液和400倍液处理后玉米幼苗中CAT活性均显著提高，施药14 d后达抑制峰值，且200倍液处理植株幼苗中CAT活性显著高于400倍液。14～21 d各处理CAT活性呈下降趋势，但200倍液和400倍液处理植株中CAT活性仍显著高于对照组。表明随污泥活性提取物浓度升高，玉米幼苗中CAT活性增强，200倍液对玉米植株有明显抑制作用，结果如图3所示。

图1　提取物对玉米幼苗SOD活性影响Fig.1　Effect of extract on maize seedling SOD activity

图2　提取物对玉米幼苗POD活性影响Fig.2　Effect of extract on maize seedling POD activity

图3　提取物对玉米幼苗CAT活性影响Fig.3　Effect of extract on maize seedling CAT activity

2.5　城市污泥腐殖土粗提物对植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性影响

粗提物200倍液和400倍液处理玉米植株，其体内PAL酶活性显著高于对照。出苗14 d达抑制峰值。14～21 d粗提物200倍液和400倍液处理玉米植株体内PAL活性呈下降趋势，但活性仍高于对照。由此可知，当玉米植株受城市污泥腐殖粗提物刺激时，体内PAL酶活性增强，粗提物对玉米植株产生胁迫作用，结果如图4所示。

2.6　城市污泥腐殖土粗提物对植物肉桂酸-4氢化酶的(C4H)活性影响

粗提物200倍液和400倍液处理玉米植株，其体内C4H活性显著高于对照。施药后14 d达抑制峰值，且200倍液处理植株体内C4H活性显著高于400倍液。14～21 d，粗提物200倍液处理植株体内C4H活性降低，400倍液处理植株体内C4H活性上升，但两者C4H活性仍高于对照。由此可知，经粗提物处理玉米植株体内C4H酶活性增强，粗提物对玉米植株产生胁迫作用，结果如图5所示。

2.7　城市污泥腐殖土粗提物对植物4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)活性影响

经粗提物200倍液和400倍液处理玉米植株，出苗14 d其体内C4H活性均显著高于对照，出苗21 d达抑制峰值，体内C4H活性分别较对照高34.44%和9.10%，且200倍液处理组玉米体内4CL酶活性显著高于400倍液。说明随污泥活性提取物浓度增大，玉米体内4CL酶活性上升，200倍液粗提物对玉米植株有显著抑制作用，如图6所示。

图4　提取物对玉米幼苗PAL活性影响Fig.4　Effect of extract on maize seedling PAL activity

图5　提取物对玉米幼苗C4H活性影响Fig.5　Effect of extract on maize seedling C4H activity

图6　提取物对玉米幼苗4CL活性影响Fig.6　Effect of extract on maize seedling 4CL activity

2.8　城市污泥腐殖土粗提物中活性物质分离情况

种子萌发试验确定200倍液腐殖土活性粗提物对小白菜和水萝卜种子萌发抑制作用较强。因此，以200倍液腐殖土活性粗提物为供试溶液。薄层色谱法选择洗脱剂，以正丁醇∶酒精∶水为9∶1∶1体系作为洗脱剂效果最好。馏分1的Rf为0.65，其他均为0.59，合并相同馏分并旋转蒸发溶剂，结果如表5、图7所示。

表5　硅胶分离提取物Rf值Table 5　Rfvalue of the extract by silica gel column

图7　硅胶分离提取物TLC图谱Fig.7　TLC of the extract by silica gel column

2.9　城市污泥腐殖土活性物质对水稻种子发芽和α-淀粉酶活性影响

对两个馏分作活性跟踪试验并测定其效果，36 h对照种子发芽率为100%，馏分1和馏分2处理后水稻种子发芽率分别为34%和90%，至72 h馏分1处理后水稻种子萌发率仅为42%。可见，馏分1对水稻种子具有明显抑制作用（见表6）。制备各浓度麦芽糖标准溶液，并在540 nm波长下测定各标准溶液吸光度，绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.1681x-0.1549，R2=0.9956，如图8所示。

根据标准曲线计算对照组及馏分1的α-淀粉酶活力，结果如表7所示。α-淀粉酶活力与种子发芽率呈显著正相关，馏分1处理水稻种子α-淀粉酶活性及种子发芽率均显著降低，表明腐殖土中3-羟基苯甲酸通过影响α-淀粉酶活性显著降低水稻种子发芽率。

表6　馏分对水稻种子萌发率影响Table 6　Effects of distillates on rice seed germination rate （%）

图8　麦芽糖标准曲线Fig.8　Maltose standard curve

表7　活性物质对α-淀粉酶活性影响Table 7　Effects of active substances on a-amylase activity

图9　提提取物红外(IR)谱图Fig.9　IR of extract

2.10　城市污泥腐殖土活性物质鉴定

对馏分1作红外光谱检测，波数3 420 cm-1对应羟基O-H伸缩振动吸收峰，波数2 953 cm-1对应苯环=C-H不饱和伸缩振动峰，波数1 080 cm-1对应C=C不对称伸缩振动吸收峰，波数1 702 cm-1对应C=O羰基伸缩振动峰，波数788 cm-1对应苯环-C=H面外弯曲并有三个相邻氢。结合红外数据鉴定馏分中含有化合物3-羟基苯甲酸，结果见图9、10。

图10　活性提取物分子结构Fig.10　Molecular structure of the active extract

3　讨论与结论

目前污泥中己提取生物活性物质包括腐植酸、氨基酸、维生素、生长素，其中腐植酸和生长素对植物生长发育和抗逆性影响显著[23-24]。城市污泥处理后形成腐殖土中含有抑制种子发芽活性物质。吴凤芝等研究表明，黄瓜连作土壤中含羟基苯甲酸类物质，此类化合物处理黄瓜幼苗后抗逆酶POD、CAT活性显著升高，表明羟基苯甲酸类物质对植物生长有抑制作用[25]。本研究采用透析旋转蒸发法分离污泥腐殖土粗提物，利用薄层层析和柱层析结合红外光谱对粗提物纯化和初步结构鉴定，获得活性物质结构为3-羟基苯甲酸，随含有该化合物腐殖土粗提取物浓度增加，供试植株体内SOD、POD、CAT、PAL、C4H及4CL活性增高，表明该化合物对植株生长产生胁迫作用，与吴凤芝等研究结果基本一致。王璞等利用羟基苯甲酸浸种试验表明，高浓度羟基苯甲酸类物质显著降低棉花种子发芽率，种子生长受显著抑制[26]，但未明确羟基苯甲酸类物质作用机理。α-淀粉酶是水稻种子萌发初期最重要水解酶，胚乳中碳水化合物在α-淀粉酶作用下转化为糖，为胚提供形成新组织原料和发芽能量[27]。本文初步鉴定污泥腐殖土提取物活性物质为3-羟基苯甲酸，随该物质浓度增加，供试种子发芽率下降，种子萌发受抑制，时间延长，且证实该化合物对水稻种子发芽过程中α-淀粉酶活性产生显著抑制，是影响种子正常萌发、导致发芽率明显降低重要机制。