杞精明目汤含药血清对结膜松弛症MAPK信号通路的影响

贾元玲，项敏泓，黄丽，李青松，文杭，詹月萍

结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCh）是年龄相关性眼病，随着人口老龄化的加剧，患病率逐年上升。患者出现不同程度的角膜炎、睑板腺炎、干眼及相关的眼表炎症。Mimura等[1]调查东京医科大学医院就诊1~94岁共1416例人群中CCh患病率为85.24%。Zhang等[2]对≥60岁社区老年人调查发现CCh患病率为39.01%。Pearson[3]发现在各类眼表疾病中，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路对介导炎症和调控细胞凋亡起着一定的作用。前期研究发现随着CCh病程的加重，松弛结膜组织中MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶 （extracellular signal-regulated kinases,ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及p38 MAPK蛋白表达均有所增强[4]，中药杞精明目汤治疗CCh取得了较好效果[5]。因此本研究旨在进一步通过细胞实验探讨杞精明目汤是否通过MAPK信号通路发挥调控作用，为临床上应用该方治疗CCh提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1组织标本研究用结膜组织来自于2016年4月—2017年1月在上海中医药大学附属普陀医院眼科确诊为CCh，且符合手术适应症行新月形松弛结膜切除术的CCh的患者[6]，共7例（7只眼），诊断标准参照文献[7]。其中Ⅱ级2只眼、Ⅲ级3只眼、Ⅳ级 2 只眼。 年龄 59～82 岁，平均（69.43±8.24）岁。 取材是由同一术者采用相同的方法采集，研究方案已通过上海中医药大学附属普陀医院伦理委员会批准，并对所有患者进行知情同意。

1.1.2实验动物雄性SD大鼠30只，普通级（CV），体质量（200±20） g（上海中医药大学附属普陀医院中心实验室动物房提供）。

1.1.3药物杞精明目汤：黄精20 g、麦冬20 g、旱莲草 15g、枸杞子 15g、茯苓 10g、川芎 3g、炙甘草 3g。根据 “人和动物之间按体表面积折算的等效计量比值”计算出与70 kg成人用药量相当的200 g大鼠的等效计量，将药液浓缩为含生药3.35 g/ml，于4℃冰箱保存备用[8]。

1.1.4主要试剂DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液（美国Gibco公司）、0.25%胰蛋白酶溶液、牛血清白蛋白（BSA）（美国 Sigma公司）。 Trizol、cDNA 第一条链合成试剂盒、荧光定量聚合酶链反应试剂盒（日本 Takara公司）；p38 MAPK、JNK、ERK 的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国Abcam公司，货号 ：ab176664、ab176662、ab176660）；抗 体p38 MAPK、p-p38 MAPK（磷 酸 化 p38 MAPK）、JNK、p-JNK （磷酸化 JNK）、ERK、p-ERK （磷酸化 ERK）、β-actin（美国 CST 公司，货号：#4695、#4370、#9252、#9251、#8690、#4511、4967S），辣 根 过 氧 化 物 酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗、RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、BeyoECL Plus（上海碧云天公司）；引物、荧光探针p38 MAPK、JNK、ERK、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（上海生工公司）。

1.1.5主要仪器CO2培养箱（日本SANYO公司），超净工作台（苏净集团安泰公司），倒置显微镜（德国WILOVERT公司），低温高速离心机（德国Eppendorf公司），荧光定量 PCR仪 ABI7300（美国ABI公司），标检测仪、垂直电泳槽、转膜仪（美国BIO-RAD公司），化学发光分析系统仪（中国培清公司）。

1.2　实验方法

1.2.1人结膜成纤维细胞培养切取松弛结膜组织平铺于6孔板内，将6孔板翻转为底朝上，然后置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中，待组织块周边接近干燥（约1~3 min）将6孔板翻转，于超净台中缓慢加入3 ml含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养液，勿使组织浮起，继续培养，每3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及培养情况[9]。

1.2.2药物血清的制备及实验分组实验共分3组：分别为CCh+20%含药血清组 （简称含药血清组）、CCh+20%无药血清组（简称无药血清组）、CCh对照组。将30只SD大鼠编号，按随机数字表分为含药血清组和无药血清组，每组15只。含药血清组予杞精明目汤灌胃，无药血清组予生理盐水灌胃，均每次2 ml/只，每日2次，连续5 d。最后1次灌胃2 h后 （灌胃前12 h禁食不禁水），2.5%戊巴比妥钠1.5 ml/kg腹腔麻醉后，消毒，无菌操作下打开腹腔，腹腔动脉采血，静置2 h，2000 r/min离心25 min，无菌操作下分离出血浆，56℃水浴灭活30 min，0.22 μm过滤器过滤后-20℃下保存备用。临用前用含1%青-链霉素的DMEM培养液配制成20%的含药或无药血清。

1.2.3药物血清干预实验选择3～6代80%融合的对数生长期CCh成纤维细胞．将细胞培养基换为无血清培养基继续培养24 h后，弃去培养基，分别加入20%含药或无药血清的细胞全培养基，同时设PBS阴性对照组，继续培养至4 h分别提取各组的RNA用于反转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR,RT-PCR）检测，剩余细胞继续培养48 h提取蛋白质，用于Western Blot实验。

1.2.4ELISA检测选取3～6代呈对数生长期细胞，将生长至90%的细胞弃去培养基，用PBS洗2次，并加入试剂盒中的裂解液500 μl裂解细胞，离心后取上清液，置于无菌EP管中，分装后-80℃冷冻保存，ELISA试剂盒检测p38 MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 的相对浓度，酶标仪在 450 nm波长处检测，测量各孔的光密度D（450 nm），重复3次。

1.2.5Western Blot检测BCA法检测蛋白浓度，并调整各组蛋白浓度至同一水平，蛋白变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白：蛋白上样量取20 μg，上层胶5%，下层胶10%，上层胶电压80 V，下层胶电压120 V，垂直电泳1.5 h，湿转膜2 h，电流300 mA，将凝胶上的蛋白转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%BSA室温封闭 2 h，4℃孵育一抗过夜，用TBTS洗涤3次，每次10 min。HRP标记的抗兔IgG二抗室温孵育对应的一抗1h，用TBTS洗涤3次，每次10 min，增强化学发光法（ECL）曝光，化学发光分析系统仪拍照。以β-actin为内参，采用Image J分析软件对条带进行半定量分析，计算p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋白的相对表达量，重复3次。

1.2.6RT-PCR检测以oligd（T）18为引物，mRNA模板1 μg，合成cDNA第一链；荧光定量PCR按20 μl反应体系进行：10×PCR 缓冲液 10 μl，上游引物 1 μl， 下游引物 1 μl， 荧光探针 1 μl，cDNA 1 μl，PCR级ddH2O 6 μl。样品和内参均设复孔，引物探针由上海生工生物工程有限公司合成，引物探针序列见表 1。 反应条件为：①95℃1min，95℃30s，60℃30s，共40个循环，ABI7300全自动荧光定量PCR仪。反应结束后，电脑自动分析荧光信号并将其转换为CT值；②目的基因相对表达水平的计算：直接用样品的各自内源控制物GAPDH的表达来标准化加入的初始RNA量，即每个样品的靶基因的相对表达水平△Ct值=靶基因Ct值-GAPDH的Ct值；通过比较不同组的△△Ct值=△Ct1-△Ct2，计算 2-△△Ct值，间接反映各组模板的起始拷贝数之间的倍数关系，重复 3次。

表1　RT-PCR引物序列及产物长度

1.3　统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料以s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　结膜成纤维细胞生长情况

收集的结膜组织块，贴壁培养3～6 d后，可观察到组织块呈暗色遮光区域，透亮性差，组织周围有细胞爬出，细胞体积较大，以梭形为主，也可见不规则三角形状；培养20 d左右可汇合成单层贴壁细胞，利用差速贴壁法，用胰酶消化，待成纤维细胞变圆并部分脱壁时，加入含血清的培养液终止消化，轻轻吹打制成细胞悬液，分瓶接种，2～3代后可得到纯度较高的成纤维细胞。处于对数生长期的细胞，紧密连接，排列较为规则，为纤维样细胞，大小均一，呈放射状、编织状排列，细胞核呈卵圆形，细胞间互相交联。经过倒置显微镜对细胞形态观察，免疫荧光和流式细胞术对培养的CCh结膜成纤维细胞进行特异性蛋白检测，鉴定为成纤维细胞后用于后续实验（图1）。

图1　倒置显微镜下观察结膜成纤维细胞。1A.原代培养3～6 d后，观察组织块呈暗色遮光区域，透亮性差，组织周围有细胞爬出，细胞体积较大，以梭形为主，也可见不规则三角形状；1B.为处于对数生长期的细胞，细胞紧密连接，排列较为规则，为纤维样细胞，大小均一，呈放射状、编织状排列，细胞核呈卵圆形，细胞间互相交联

2.2　ELISA 检测 p38 MAPK、JNK、ERK（图 2）

p38 MAPK与p-p38 MAPK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的p38 MAPK光密度值分别为2.44±0.33、3.34±0.43、3.92±0.76 （单因素方差分析，F=5.772，P=0.040）；p-p38 MAPK 的光密度值分别为0.11±0.03、0.13±0.02、0.17±0.01（F=6.741，P=0.029）。含药血清组p38 MAPK、p-p38 MAPK的光密度值明显低于 CCh 对照组（P=0.015，P=0.011），无药血清组与CCh对照组的p38 MAPK及p-p38 MAPK差异无统计学意义（P=0.233，P=0.075）。

JNK与p-JNK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的 JNK光密度值分别为 1.79±0.09、1.91±0.06、1.96±0.02（F=5.665，P=0.041）；p-JNK 的光密度值分别为 0.23±0.02、0.24±0.02、0.28±0.01（F=9.451，P=0.014）。含药血清组的JNK、p-JNK光密度值较CCh 对照组明显降低（P=0.017，P=0.023），无药血清组JNK光密度值与CCh对照组接近 （P=0.376），p-JNK光密度值低于CCh对照组（P=0.006）。

图2　ELISA检测20%杞精明目汤对CCh结膜成纤维细胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 表达的影响。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，与CCh对照组比较，*P<0.05；与无药血清组比较，▲P<0.05。　ELISA：酶联免疫吸附试验　CCh：结膜松弛症　MAPK：丝裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶　ERK：细胞外信号调节激酶p-：磷酸化

图3　Western Blot检测20%杞精明目汤对CCh结膜成纤维细胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋 白表达量的影响。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK法，*P＜0.05 CCh：结膜松弛症 MAPK：丝裂原活化蛋白激酶JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：细胞外信号调节激酶　p-：磷酸化

ERK与p-ERK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的ERK光密度值分别为 2.41±0.03、2.85±0.04、2.94±0.01（F=288.107，P＜0.001）；p-ERK 的光密度值 分别 为 1.44±0.12、1.75±0.09、1.82±0.14 （F=8.519，P=0.018）。含药血清组ERK与p-ERK光密度值均低于 CCh 对照组（P＜0.001，P=0.008），无药血清组ERK、p-ERK光密度值与CCh对照组差异均无统计学意义（P=0.051，P=0.511）。

2.3　Western Blot检测 p38 MAPK、JNK、ERK 蛋白表达（图3）

p38 MAPK与p-p38 MAPK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的p38 MAPK蛋白相对表达量分别为 0.75±0.36、1.21±0.65、1.67±0.72，差异无统计学意义（F=1.756，P=0.251）。 各组 p-p38 MAPK 蛋白相对表达量分别为 1.13±0.14、1.15±0.19、1.75±0.33，含药血清组、无药血清组数值明显低于CCh对照组（P=0.019，P=0.017），且以含药血清组 p38 MAPK 蛋白磷酸化水平下调更为明显。

JNK与p-JNK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的JNK蛋白相对表达量分别为1.69±0.84、2.12±0.50、2.74±0.59，差异无统计学意义（F=1.953，P=0.222）。三组p-JNK蛋白相对表达量分别为0.98±0.69、1.23±0.84、1.76±1.22， 组间差异亦无统计学意义（F=0.537，P=0.610）。

ERK与p-ERK：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的ERK蛋白相对表达量分别为1.42±0.60、1.84±0.49、2.19±0.70，组间差异无统计学意义 （F=1.210，P=0.362）。三组p-ERK蛋白相对表达量分别为 0.69±0.14、1.10±0.30、2.46±0.29 （F=39.380，P＜0.001），含药血清组、无药血清组数值较CCh对照组明显降低（P=0.001，P＜0.001），且含药血清组的 ERK蛋白磷酸化水平下调更为明显。

2.4　RT-PCR 检测 p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 表达（图 4）

p38 MAPK mRNA：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的p38 MAPK mRNA表达量分别为0.19 ±0.12、0.33 ±0.11、1.00 ±0.00（F=62.001，P ＜0.001），含药血清组、无药血清组的p38 MAPK mRNA表达量均明显低于 CCh对照组 （P＜0.001，P＜0.001），可见无药血清和含药血清皆可降低CCh的p38 MAPK mRNA的表达，而20%杞精明目汤含药血清对p38 MAPK mRNA水平下调更为明显。

JNK mRNA：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的 JNK mRNA表达量分别为 0.40±0.20、0.44±0.15、1.00±0.00 （F=16.214，P=0.004）， 前两组 JNK mRNA表达较CCh对照组明显下降 （P=0.003，P=0.002），其中20%杞精明目汤含药血清对JNK mRNA水平下调更为明显。

ERK mRNA：含药血清组、无药血清组、CCh对照组的 JNK mRNA表达量分别为 0.22±0.08、0.35±0.12、1.00±0.00 （F=74.035，P＜0.001）， 前两组 JNK mRNA表达也较CCh对照组明显下降（P＜0.001，P＜0.001），其中20%杞精明目汤含药血清对ERK mRNA水平下调更为明显。

图4　RT-PCR检测20%杞精明目汤对CCh结膜成纤维细胞p38 MAPK、JNK、ERK mRNA表达的影响。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，*P＜0.05 RT-PCR：反转录聚合酶链反应　CCh：结膜松弛症MAPK：丝裂原活化蛋白激酶　JNK：c-Jun氨基末端激酶ERK：细胞外信号调节激酶

3　讨论

CCh是由于球结膜过度松弛和/或下睑缘张力高，造成松弛球结膜堆积在眼球与下睑缘、内、外眦部之间形成皱褶，引起眼表泪液学异常，常伴有眼部干涩、异物感、溢泪不适等症状的疾病，严重者影响视觉和生活质量，但是目前除手术外缺乏有效治疗方法[10-11]。故将研究方向转移到中医领域，以期在中医中药领域寻求更为安全有效的治疗方法。

CCh属于中医眼科学领域的“白涩症”范畴，证型多为肝肾阴虚，临床表现为眼内干涩不爽，双目频眨，羞明畏光，白睛隐隐淡红，久视后诸症加重。肝开窍于目，肝脉连目系，肝气通于目，肝和则目能辨五色，泪为肝之液，肝阴不足，目失所养可致眼干涩不舒，治疗多以补肝肾，养肝明目为主。我们在经验方的基础上研制的杞精明目汤，方中黄精、枸杞子、麦冬滋补肝肾，养阴生津，补益先天精血，共为君药；茯苓、炙甘草健脾益气以助生化；阴虚生内热，旱莲草补肝肾之阴以清热凉血；川芎上行头目，引药上行。全方滋补肝肾，培补先天之精血；健脾益气，以助精血之生化。既往研究发现杞精明目汤在维护泪膜稳定性的同时，可改善泪液中的黏蛋白，促进眼表组织损害的修复，改善泪液功能，从而治疗CCh[12]。

MAPK是细胞内一类进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于自然界的大多数细胞中。它可以被细胞外的多种刺激因素或信号分子所激活，生理刺激如激素、生长因子、细胞因子等，病理性刺激如缺血再灌注，渗透压的改变以及炎症反应等。MAPK家族主要包含细胞外信号调节激酶（ERK），c-Jun 氨基末端激酶 （JNK），p38 MAPK 和ERK5/大丝裂原活化蛋白激酶1（big mitogen-activated protein kinase,BMK1）4条信号通路[13]。 研究证实在干眼等眼表疾病中，前三种信号通路对介导和调控炎症因子起着一定的作用[14]。在干眼动物模型中，发现早期眼表上皮内即出现ERK、JNK以及p38 MAPK通路的活化，并出现了炎症介质白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α） 以及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的浓度增高[15]。CCh作为一种特殊类型的干眼，松弛结膜组织存在ERK、JNK及p38 MAPK蛋白表达增强[4]。本研究结果证实20%杞精明目 汤 含 药 血 清 对 p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的蛋白表达和基因转录均具有调控作用，尤其是20%杞精明目汤含药血清能够显著抑制p38 MAPK、ERK蛋白的磷酸化水平和p38 MAPK、JNK、ERK mRNA 的表达（P＜0.05），这就进一步从实验层面证明了杞精明目汤治疗CCh的有效性，可能通过干预MAPK信号通路中的关键分子从而治疗CCh。

对杞精明目汤的中药成分进行分析发现多味中药皆有不同程度的抗炎作用且与MAPK信号通路相关：枸杞多糖与炎症介质和MMPs的表达密切相关[16]，且能显著抑制紫外线 B（UVB）诱导的p38 MAPK激活，逆转半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspases-3）的活化和MMP-9的表达[17]，通过磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶（PI3K/Akt）信号通路调节JNK的磷酸化水平[18]。黄精多糖能降低实验性动脉粥样硬化家兔血清IL-6及C反应蛋白（CRP）水平[19]，可减轻炎症反应，提高氧自由基清除能力[20]。麦冬能促进细胞的生长增殖，促进生长因子释放，抑制炎症反应[21]，通过抑制TNF-α的水平进一步抑制p38 MAPK的活化[22]。茯苓多糖化合物具有抗炎作用，其作用机制主要是抑制脂多糖诱导的巨噬细胞相关基因的表达，并抑制细胞外信号分子介导的ERK、JNK基因的表达[23]。炙甘草可降低血清MMP-9及MMP-9/TIMP-1（金属蛋白酶组织抑制剂-1）的表达[24]，并显著降低血清 TNF-α 的水平[25]。

由于CCh松弛结膜组织中MAPK相关信号通路蛋白表达明显增强，提示MAPK信号通路参与了CCh的发展过程[4]，且在CCh中热休克蛋白27（heat shock protein 47,HSP27）表达上调[26]，热休克蛋白可进一步激活ERK和JNK信号通路使MMP-1和MMP-3的表达增加[27]。MAPK信号通路可以通过激活各种靶细胞的 TNF-β和激活蛋白-1（activator protein-1,AP-1）等转录因子调控MMPs的数量和活性[28]。因此我们猜测MAPK通路被磷酸化激活后作用于MMPs等底物，可能导致了CCh的发生与发展。本研究通过细胞实验证实MAPK通路参与了CCh的发病过程，而20%杞精明目汤含药血清可以显著抑制CCh成纤维细胞MAPK信号通路相关蛋白及基因的表达，可能减少MMPs的产生，起到了治疗CCh的功效。杞精明目汤含药血清对MAPK信号通路的干预作用是通过多途径实现的，包括调节MAPK信号通路相关蛋白的磷酸化水平、抑制炎症因子表达、减少致纤维化因子表达等。由于本实验是采用含杞精明目汤全方的药物血清进行干预研究，含有君臣佐使的各种成分，故不能断定是药物相互协同起效，还是某味药物或其单体的作用，尚需进一步研究明确。