竹柏果油提取工艺优化及理化特性分析

吕露露 杨崇文 李承勇, 孙省利, 闫协民 苏添添 冯彦婷

(1. 广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088;2. 湛江市海岸带生态工程技术研究开发中心，广东 湛江 524088)

人体血清中总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇含量过高易诱发冠心病和脑梗死[1]。研究[2-3]发现，不饱和脂肪酸可参与胆固醇酯化过程，提高不饱和脂肪酸的摄入量可降低血清中胆固醇的含量。为此，寻找自然界中优质不饱和脂肪酸的来源，尤其是具有显著生物活性的长链不饱和脂肪酸(C20以上)已成为科研人员关注的热点[4]。然而由于渔业资源日益减少，有效成分及纯度符合要求的长链不饱和酸原料十分有限(主要集中于沙丁鱼、三文鱼、金枪鱼等深海鱼类)，再加上提纯工艺繁琐复杂等问题使得开发成本较高。虽然植物油脂提纯工艺相对简单且成本可观，但其脂肪酸组成中长链不饱和脂肪酸的比例一般较低。

竹柏(Podocarpusnagi)为罗汉松科(Podocarpacese)罗汉松属植物，是古老的裸子植物，起源于中生代白垩纪，被人们称为“活化石”[5]。竹柏作为常绿乔木，在中国主要分布于华南地区、台湾和云南南部，越南、柬埔寨也有分布[6]。竹柏根茎及枝叶中含有多种活性成分，包括黄酮、环肽及二萜类化合物等，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，为各地植物志所记载[7]。竹柏经种子繁殖后10年左右可开花结果，其果仁含油量较高。有数据显示，竹柏盛果期单株产果高，种子含油量可达30%[8]，但其脂肪酸的含量及成分还尚不明确。目前关于竹柏的研究主要集中在叶子和枝干等方面，谢黛等[9]在竹柏叶中提取出了黄酮物质，而刘娟等[10]对长叶竹柏的叶子和枝干的化学成分进行了分离与鉴定。但对于竹柏果实成分和应用的研究还未有报道。本试验拟以成熟的竹柏果为原料，对超声波辅助索氏抽提竹柏果油的工艺进行优化，并研究该油脂的基本理化性质及脂肪酸组成，为提取不饱和脂肪酸尤其是长链不饱和脂肪酸提供更多的来源，并为后期竹柏果实中竹柏果油的提取纯化工艺和竹柏资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

竹柏果：廉江市某种植基地，经晒干于-20 ℃冰箱储存，使用前去皮、壳，取其果仁；

所用试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

集热式磁力加热搅拌器：DF-101S型，金坛市医疗仪器厂；

超声波清洗机：JP-040S型，深圳市洁盟清洁设备有限公司；

万分之一电子天平：BSA224S-CW型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

超纯水一体机：D24-UV型，默克密理博试验室设备(上海)有限公司；

台式高速大容量冷冻离心机：5810R型，艾本德中国有限公司；

循环水式真空泵：SHZ-O(Ⅲ) 型，巩义市予华仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-3000B型，巩义市予华仪器设备工贸有限公司；

冷凝水泵：CCA-20型，巩义市宏华仪器设备工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 将竹柏果仁经超纯水充分清洗后先于60 ℃ 烘箱中干燥待其自然冷却后研磨备用。

1.2.2 基本成分和理化指标测定

(1) 粗蛋白：参照文献[11]。

(2) 粗脂肪：参照文献[12]。

(3) 灰分：参照文献[13]。

(4) 酸值、过氧化值、水分及挥发物、碘值和皂化值：按GB/T 5528—2008系列方法执行。

1.2.3 提取率的测定 称取4.0 g经研磨的竹柏果仁，用滤纸包裹好置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶40 (g/mL)加入正己烷，用超声波清洗机(功率：240 W，温度：25 ℃)超声6 min 后，将样品滤纸包放入抽提筒中，将提取溶剂倒进250 mL 平底烧瓶中，于75 ℃水浴加热，回流150 min。提取结束后将提取液过滤，滤液经减压蒸馏、干燥、恒重，按式(1)计算竹柏果仁油提取率。

(1)

式中：

R——竹柏果油提取率，%；

m1——竹柏果仁油质量，g；

m2——竹柏果仁粉质量，g。

1.2.4 竹柏果油提取工艺优化

(1) 提取溶剂的选择：固定超声时间6 min，提取温度75 ℃，提取时间150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分别考察正己烷、石油醚、乙酸乙酯对竹柏果油得率的影响。

(2) 超声时间的选择：固定提取溶剂为正己烷，提取温度75 ℃，提取时间150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分别考察不同超声时间(2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 min)对竹柏果油得率的影响。

(3) 提取温度的选择：固定提取溶剂为正己烷，超声时间6 min，提取时间150 min，料液比1∶40 (g/mL)，分别考察不同提取温度(60，65，70，75，80，85，90 ℃)对竹柏果油得率的影响。

(4) 提取时间的选择：固定提取溶剂为正己烷，超声时间6 min，提取温度75 ℃，料液比1∶40 (g/mL)，分别考察不同提取时间(60，90，120，150，180，210，240 min)对竹柏果油得率的影响。

(5) 料液比的选择：固定提取溶剂为正己烷，提取温度75 ℃，提取时间150 min，超声时间6 min，分别考察不同料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90，1∶100，1∶110 (g/mL)]对竹柏果油得率的影响。

1.2.5 响应面优化竹柏果油提取工艺 以单因素结果为基础，选取提取温度、回流时间、料液比3个因素设计正交试验，每个因素设置3个水平，对提取条件进行优化。

1.2.6 脂肪酸组成分析

(1) 甲酯化：取竹柏果油20 mg于50 mL平底烧瓶中，加入2 mL正己烷充分涡旋溶解后，再加入2% 氢氧化钠-甲醇溶液5 mL混匀，置于60 ℃水浴锅加热，直至液面上的油滴消失，加入浓度为16%的三氟化硼溶液2 mL，加热15 min，冷却至室温，转入50 mL比色管中，用饱和氯化钠溶液清洗平底烧瓶，并转入比色管中，振荡1～2 min，静置10 min，取比色管中上清液过0.2 μm微孔滤膜到进样瓶，作为GC-MS分析试样[14]。

(2) GC-MS分析：载气是高纯氮气；色谱柱初始温度为50 ℃，恒温0.5 min后，以55 ℃/min升至155 ℃，再以8 ℃/min 升至175 ℃，然后以1.2 ℃/min升至187 ℃，最后以9 ℃/min升至280 ℃[15]；色谱柱为HP-530 m×0.25 mm×0.25 μm弹性石英毛细管柱[16]。进样口温度250 ℃，进样量1 μL；分流比100∶1；扫描模式SCAN，SIM；He流速45 cm/s。

(3) 定量分析：将100 mg混合标准样品用正己烷溶解，并定容至2 mL得浓度为50 mg/mL，再用正己烷分别稀释至40.0，25.0，10.0，5.0，2.0，0.6 mg/mL系列的标准溶液，然后用GC-MS/SIM对其进行分析，以峰面积和质量浓度作定量工作曲线。使用相同的GC-MS操作条件和过程来分析竹柏果仁油试样，并基于定量离子的响应值和建立的标准曲线进行绝对定量[17]。

1.2.7 数据处理 采用Origin 8.5、SPSS 19.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂对竹柏果油得率的影响 由图1可知，乙酸乙酯提取率最高，与石油醚相比差异不明显(P>0.05)，与正己烷相比差异显著(P<0.05)。乙酸乙酯提取油量最大的原因，可能与乙酸乙酯的极性较大有关，也可能是竹柏果仁油以不饱和脂肪酸为主，其中的不饱和双键能与乙酸乙酯反应形成新的价键，并且加入乙酸乙酯后，油脂的初始运动黏度降低[18]，有助于油脂在乙酸乙酯中的溶解。这两方面的原因使乙酸乙酯对竹柏果仁油的提取率最高。提取溶剂对得油率有很大的影响，合适的提取溶剂不仅能使油料细胞在超声情况下发生破碎，还能使油料中的有效成分充分溶出。由于乙酸乙酯价格较高，并且可能造成油样成分损失，石油醚的毒性较高，危险性大。因此综合考虑提取效果、经济成本和安全问题，选用正己烷为提取溶剂进行后续试验。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图1 溶剂对竹柏果出油率的影响Figure 1 Effect of different solvents on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.1.2 超声时间对竹柏果油得率的影响 由图2可知，超声时间6 min前，竹柏果油提取率随着时间的延长而增加，在6～12 min时竹柏果油的提取率变化较为平缓，差异不显著，在14 min时出现上升趋势后又趋于平缓，甚至低于6 min的提取率，可能是超声加速了正己烷的挥发所致。同时，长时间超声，能量消耗较大。因此，选择超声时间为6 min 进行后续研究。

2.1.3 提取温度对竹柏果油得率的影响 由图3可知，温度低于70 ℃，竹柏果油提取率随着提取温度的上升而增加，温度的上升会促进溶剂对物料的渗透；在70～85 ℃时提取率的变化趋于稳定；而高于85 ℃，提取率逐渐下降，可能是温度过高，溶剂的蒸发速度加快，对样品的浸提时间减少，使得提取率下降。因此，最终选定65～75 ℃进行响应面优化试验。

2.1.4 提取时间对竹柏果油得率的影响 由图4可知，提取时间在150 min以前随着提取时间的延长，竹柏果油的提取率增长较快，超过150 min后，提取率变化不显著。为此应选择150 min为响应面优化试验的中心点。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图2 超声时间对竹柏果出油率的影响Figure 2 Effect of change of ultrasonic time on the oil yield rate Podocarpus nagi

不同字母表示差异显著(P<0.05)图3 提取温度对竹柏果出油率的影响

Figure 3 Effect of change of extraction temperature on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

不同字母表示差异显著(P<0.05)图4 提取时间对竹柏果出油率的影响

Figure 4 Effect of change of extraction time on the oil yield rate ofPodocarpusnagi

2.1.5 料液比对竹柏果油得率的影响 由图5可知，随着提取剂的增加，反应体系的渗透压越大，竹柏果油在溶剂中的扩散速度也会提高，提取率随之上升。当料液比超过1∶40 (g/mL)后，竹柏果油提取率的增加不明显，趋于平缓。进一步增加提取剂会增加提取成本。因此，选择料液比1∶40 (g/mL)为响应面试验的中心点。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图5 料液比对竹柏果出油率的影响Figure 5 Effect of change of liquid ratio on the oil yield rate of Podocarpus nagi

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验方案设计及结果分析 以竹柏果仁油提取率(R)为响应值，选择提取温度、提取时间、料液比3个因素设计正交试验，每个因素设置3个水平，进一步优化提取条件，试验因素与水平见表1，试验设计及结果见表2。

使用Design expert 8.0.6软件对模型列回归方程，得到竹柏果仁油得率对提取温度、回流时间、料液比的二次多项回归模型方程：

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Response surface test factors and levels

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

(2)

不同因子交互作用的3D响应面图见图6～8，结合回归模型X1X2、X1X3和X2X3的P值大小分析知，X1(提取温度)和X3(料液比)对到竹柏果仁油提取率的交互作用相对明显。

表3 回归模型方差分析†Table 3 Regression model analysis of variance

† **表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。

图6 提取温度与提取时间的交互作用Figure 6 Interactive effects extraction temperature and extraction time

图7 提取温度与料液比的交互作用Figure 7 Interactive effects extraction temperature and solid-liquid ratio

2.3 验证性实验

采用Design-expert 8.0.6软件对响应面模型进行拟合，得最适提取条件为料液比1∶42.89 (g/mL)、提取温度73.16 ℃、提取时间166.15 min，预测竹柏果仁油提取率31.22%。结合单因素优化结果并考虑到实际试验操作条件，提取工艺修正为：料液比1∶40 (g/mL)、提取温度75 ℃、提取时间150 min。此条件下进行实验验证，设置4次平行实验。得到竹柏果油的平均提取率为29.32%，由于竹柏果实存在着不同的成熟度，会导致提取竹柏果油时有一定的误差。与模型预测值误差为8.99%，与预期相近。

图8 提取时间与料液比的交互作用Figure 8 Interactive effects extraction time and solid-liquid ratio

2.4 理化指标分析

由表4可知，经检测，竹柏果仁油所测的各项理化指标符合GB 2716—2005《食用植物油卫生标准》，可应用于食品、医药保健品。按照QB/T 4079—2010《按摩基础油、按摩油》的要求，过氧化氢值≤10 mmol/kg，竹柏果仁油的过氧化氢值为27.76 mmol/kg，通过后期提取工艺的进一步改进与油脂精炼可用于化妆品行业。

表4 竹柏果仁油的理化性质†Table 4 The physicochemical properties of Podocarpus nagi nut oil

† *表示重复3次，**表示重复2次。

2.5 GC-MS分析

采用选择性离子检测的GC-MS方法对9种脂肪酸甲酯的总离子流图进行扫描，得到竹柏果仁油样品的总离子流图见图9，9种脂肪酸甲酯的含量见表5。

1. 十六碳酸 2. 十八碳酸 3. 十八碳一烯酸 4. 十八碳二烯酸 5. 十八碳三烯酸 6. 二十碳酸 7. 二十碳一烯酸 8. 二十碳二烯酸 9. 二十碳三烯酸

图9 竹柏果油GC-MS总离子流Figure 9 Total ion flow of GC-MS in Podocarpus nagi nut oil表5 竹柏果仁油GC-MS成分分析结果Table 5 Analysis results of GC-MS composition of oil in Podocarpus nagi nut oil

由表5可知，竹柏果仁油主要化学成分为脂肪酸类，鉴别出9种脂肪酸，以亚油酸、二十碳三烯酸、十八碳一烯酸为主，不饱和脂肪酸含量达到95.81%，其中C20以上的长链不饱和脂肪酸占脂肪酸组成的33.76%。不饱和脂肪酸对人类健康大有裨益，可软化血管、降低低密度脂蛋白和胆固醇、增强视力等作用[18]，其中亚油酸具有降低血中胆固醇、调节脂肪代谢、抑制或清除动脉血栓等作用。竹柏果仁油富含长链不饱和脂肪酸，在保健品领域有极大的开发前景。

3 结论

本试验以成熟的竹柏果为原料，优化了超声波辅助索氏抽提法提取竹柏果仁油的工艺条件，并研究了该油脂的基本理化性质及脂肪酸组成。研究发现，竹柏果仁油中不饱和脂肪酸含量达95.81%，且多不饱和脂肪酸总量为76.27%，显著高于单不饱和脂肪酸。竹柏果仁油亚油酸含量相比同类陆生食用油脂优势明显，C20以上的长链不饱和脂肪酸占脂肪酸组成的33.76%。本试验尚未对竹柏果仁油中不饱和脂肪酸的应用进行开发，有待进一步研究。