纳米银影响桑树组培苗生长的原因初探*

谢川星　赵振娴　熊本华　谌伦富　谈文辉　王茜龄　杜华茂

(1. 西南大学生物技术学院，重庆 400715，2. 重庆市蚕业科学技术研究院，重庆 400716)

纳米银 (Silver nanoparticles, SNP)是粒径为1-100nm的金属银单质，可由物理法、化学法或生物法等多种方法制备而成[1]。纳米银对大肠杆菌、淋球菌、沙眼衣原体乙肝病毒、流感病毒等数百种致病微生物都有强烈的抑制和杀灭作用，而且不易产生耐药性[2-3]。近30年来含纳米银的织物、日用品、卫生用品、工业用品及医疗器械等发展异常迅猛，全球全年纳米银年产量约220-320t,产值达0.79-2.54亿美元[4]。随着纳米银的大量生产与广泛应用，排放到环境中的纳米银也与日巨增，如果在土壤和自然水体中富积，对环境微生物及植物可能产生毒副作用。Qin(2010)报道水蚤暴露在含纳米银的水体中24h与48h的半数致死剂量分别为3.56μg/L,1.75μg/L，0.5μg/L即可影响水蚤的繁殖[5]。纳米银进入土壤后会对土壤微生物产生影响，改变微生物的多样性与分布特点，原因在于不同微生物对纳米银的耐受性不一致，比如氨基氧化性古细菌比细菌更敏感；而细菌中，酸杆菌门和疣微菌门比其它细菌更敏感[6]。土壤中纳米银对植物的结构、生理生化特性、生物量也会产生明显的生物效应。Barrena 等研究发现100mg/L 纳米银(粒径 29nm)处理可抑制黄瓜和生菜的种子萌发[5]。Stampoulis 等研究发现，纳米银浓度为 100mg/L、500mg/L 时，西葫芦生物量和蒸腾作用较空白组分别下降 41%和57%[7]。Dimkpa 等研究发现，纳米银(粒径 10 nm)显著降低小麦芽和根的长度，且降低程度与加入纳米银的浓度有关[3]。黑麦草种子暴露于 40mg/L 浓度的纳米银溶液中，其根系很难生长根毛，根尖细胞高度液泡化，且观察到表皮有破碎的细胞。以往的研究表明，纳米银的环境毒性与植物毒性是浓度依赖性的。

近年有研究报道利用纳米银预防家蚕的细菌性、病毒性传染病，取得较好的实验数据[7-9]。如果该法可行，纳米银将通过蚕沙进入自然环境，特别是桑园。因此，本研究利用盆栽试验，在土壤中按20mg/Kg, 40mg/Kg (土壤干重)添加纳米银，初步分析纳米银对土壤微生物及移栽桑苗生长的影响。

1　材料与方法

1.1　实验材料

桑树:嘉陵30号组培苗，2017年10月移栽入土。

纳米银购于重庆新位点生物科技有限公司，粒径20-40nm占80%。

丙酮、硝酸、高氯酸、愈创木酚、硝酸钾、异丙醇、对氨基苯磺磷酸、α-萘胺(购于萨恩化学技术有限公司)、三氯乙酸、过氧化氢等药品购于重庆化学试剂厂。

1.2　实验设计及分组

根据文献报道土壤中纳米银含20mg/Kg对黑麦草[5]作物有促进生长作用，浓度大于20mg/Kg则表现出毒性，因此本实验设20mg/Kg 、40mg/Kg两个浓度分析纳米银对桑树生长的影响。土壤经高压灭菌后干燥称重，加入纳米银并混匀,加自来水至合适的湿度，2018年1月19日栽种4月龄的桑树组苗，每组4株，放于28℃温室，每天光照10h，定期浇水，2018年3月中旬转至室外。观察桑树的生长，4个月后测定桑叶叶片中叶绿素含量、过氧化氢酶(CAT)，POD、硝酸还原酶等的酶活性；桑叶叶片，桑树木质部、韧皮部及根部纳米银含量；以及土壤中可培养细菌、真菌和放线菌的数量。

1.3　土壤可培养微生物数量的测定

采用稀释平板培养计数法。细菌于牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用高氏一号培养基(加两滴0.5%重铬酸钾)，真菌于马铃薯蔗糖培养基(加34mg/mL氯霉素)

10g土壤样品倒入装有90mL无菌水的250mL的三角瓶中(装有玻璃珠)，置于摇床上(120r/min，常温)，振荡20min，使土壤充分分散成为土壤悬液。用灭菌生理盐水作用10倍系列稀释度。各稀释度取0.1mL分别涂布三种培养基，每种三个重复。细菌于37℃培养1-3d；真菌于25℃培养3-5d；放线菌于28℃培养4-7d。选取菌落数在10-300之间的平板计数。土壤中菌落数按公式计算。

菌落数/g土壤(CFU·g-1) = 计数皿平均菌落数 ×稀释倍数/10。

1.4　纳米银的含量测定

分别取桑叶叶片、桑树木质部、韧皮部及根部，烘干粉碎。称取0.5g烘干的样品置于消化管中，加5mL 65%硝酸，于室温硝化过夜。将样品转至烧杯中，加入2mL 30%过氧化氢，在通风厨中于加热板上消解至接近干，用2%的硝酸定容至5mL。

配制纳米银标准溶液，浓度为：0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、0.7μg/mL、1μg/mL,用火焰原子吸收分光光度计(ZA3300)测定标准品及各样品的吸光度，绘制标准曲线，并换算出各样品纳米银含量。

1.5　酶活性测定

1.5.1酶液的提取

称取剪碎混匀的桑叶叶片0.3g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液(共6mL，分两次加入)和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶粗提液。

1.5.2POD酶活性的测定

按G.QIN等[5]采用愈创木酚法进行。主要步骤为各取上清液80μL，分别加入3mL反应液(300mL的0.05mol/L磷酸缓冲液，168μL愈创木酚，1.704mLH2O2pH7.0)，测定3min内470nm吸光值，按 下列公式计算酶活性。

POD活性(U·g-1·min-1·FW) =ΔD470×VT/(W×VS×0.01×t)

其中，ΔD470 —反应时间内吸光度的变化，以，W—植物鲜重，g；Vs—测定时所用酶液体积，mL；VT—提取酶液总体积，mL；t—反应时间，min。

1.5.3过氧化氢酶活性的测定

各组取2mL酶粗提液于沸水浴2min以灭活过氧化氢酶，作为对照。取0.1mL酶粗提液，加1mL Tris-HCl，1.7mL去离子水，于25℃水浴中预热3min,再加入0.2 mL 0.2mol/L H2O2溶液，混匀后立即测定A240值，每隔30s读数一次，持续测定3min。每个样品做3个重复。以1min内A240降低0.1的酶量为1个酶活单位(U)。按下列公式计算酶活。

CAT活性(U·g-1·min-1·FW) =(A240 control-A240 test)×V1/(W×V2×0.1×T)

V1：提取酶液的总体积，单位为mL；W：植物鲜重(g)；V2：测定时所用酶液体积(ml)； T：反应时间(min)。

1.5.4硝酸还原酶活性的测定

分别取各组叶片，用蒸馏水洗净、滤纸吸干、剪碎。称取0.3g放入试管。加入9mL反应液(称3.03g KNO3溶于300mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3mL异丙醇)。各组设一对照，加1mL三氯乙酸使酶失活。

将所有试管放入真空干燥器中、避光，反复抽气直至叶片沉至管底，将各试管于30℃避光保温30min。加1mL三氯乙酸，摇匀终止酶反应。静止2min，吸取上清液2mL加入另一试管，加 4mL 1%磺胺和 0.2%a-萘胺，60℃水浴保温20min，测定A540值。

按公式计算活活性：硝酸还原酶活性(U)=C×V1/(V2×W×T)

C：反应液催化产生的亚硝态氮总量(μg)，V1：提取酶液时加入的缓冲液体积(mL)，V2：酶反应时加入的粗酶液体积(mL)，W：样品质量(g)，T：反应时间(h)。

1.6　叶绿素含量的测定

称取新鲜叶片0.1g，剪成细丝状置于盛有10mL 80%丙酮的试管中，封口并用锡箔纸包裹试管。置于黑暗条件下至组织完全变白(大概要一周左右)。分别测定A663、A645、A652，按方式计算叶绿素a(Chla)和叶绿素b(Chlb)的量，叶绿素总量(CT)= Chla+Chlb。

Chla=12.72A663-2.59A645；Chlb=22.88A645-4.67A663

1.7　统计分析

本试验中三个组土壤中微生物含量、桑树不同组织纳米银含量、桑叶的过氧化氢酶、过氧化物酶、硝酸还原酶的活性、叶绿素含量以及均表示为平均数±标准差，采用软件SPSS19.0选用LSD进行多重比较，P<0.05,P<0.01分别表示差异显著、差异极显著。

2　结果

2.1　纳米银对桑树生长的影响

在温室中1个月后，低浓度纳米银组(20mg/kg土壤)桑树开始发芽，随后是对照组，高浓度纳米银组(40mg/kg土壤)桑树发芽最晚。转至室外生长后，对照组桑树的长势逐渐超过低浓度组，到第4个月，可见纳米银组桑树叶片薄、质软，逐渐枯黄(见图1)。最终，添加纳米银的实验组的株高、基径、叶片数和总叶面积都比对照组差，但因桑树苗株高不一致，未对这些参数进行统计分析。40mg/kg组桑树长势最差，移栽后5个月出现枯萎死亡。

图1　纳米银对桑树生长的影响

2.2　纳米银对土壤微生物菌群的影响

我们分别用牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯蔗糖培养基(含氯霉素)、高氏一号培养基(含重铬酸钾)培养细菌、真菌和放线菌。计数结果显示，纳米银对放线菌影响最大，每克土壤放线菌数量从32万下降至13万和9万，分别减少了57%和72%。其次是细菌，每克土壤总细菌量从4.15万下降至1.30万和1.50万，分别减少了69%和63%。每克土壤真菌从1.20万下降至0.85万和0.51万，分别减少了30%和58%(见图2)。从结果可以看出土壤中纳米银浓度超过20mg/Kg对微生物的多样性在一定的破坏作用。

2.3　桑树中纳米银的分布

本研究中两实验组人工添加纳米银至20mg SNP/kg土壤，40mg SNP/kg土壤，因长时间在室外放置，约一半纳米银随雨水流失，最后测定对照组含量为1.467mg/kg，8.289mg/kg，17.614mg/kg。对桑树根、木质部、韧皮部和叶片的银含量测定结果显示：20mg SNP/kg土壤组比对照组略高，但无显著性差异，且叶片中均未检出。除木质部外，20mg SNP/kg土壤组显著高于对照组，叶片中纳米银含量为0.8μg/g，根和韧皮部均达到1.3μg/g (图3)。

图2　纳米银对土壤微生物的影响

图3　纳米银在桑树不同组织中的分布

2.4　纳米银对桑叶叶片中酶活性及叶绿素含量的影响

将组培桑树苗移栽4个月后取桑叶进行过氧化氢(POD)，过氧化物酶(CAT)和硝酸还原酶的活性测定，结果表明土壤中的纳米银导致桑叶抗氧化酶的活性上升，两个实验组的POD分别是对照组的2.1倍、3.4倍， CAT是对照组的1.7倍、2倍；但是，硝酸还原酶活性下降5.0-8.7倍，土壤纳米银浓度越高，桑叶中酶活变化越大(见表1)。说明纳米银一方面刺激桑树产生了活性氧，桑树应激性上调两种抗氧化酶的表达以维持植株内的氧化还原电势平衡。硝酸还原酶是植物氮素同化过程的限速酶，该酶活下降说明土壤中纳米银超过20mg/kg抑制氮的生物利用。

表1　桑叶移栽4月后桑叶的酶活性与叶绿素含量测定结果

注：同行数据的肩标为不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著，相同字母或没有字母表示差异不显著。

与对照组相比，土壤纳米银对桑树叶绿素含量影响不显著，浓度为20mg/kg 时，叶绿素a、叶绿素b、稍有下降，但在40mg/kg浓度下总叶绿素含量略有上升。

3　讨论

土壤中银含量水平极低，全球平均值仅为0.01-0.50mg/kg。从已有的资料，中国土壤中银的平均水平达0.35mg/kg。由于工业行为，部分地区土壤中银含量超过背景值3-50倍[10]。在本实验中采用的土壤中银含量达1.46mg/kg。纳米银作为近三十年兴起的新型抗菌材料，由于其出色的抗多种致病微生物能力，全球每年有约2.54亿美元的产值[6]。因此，从生产环节或消费终端释放到环境中的纳米银引起了广泛关注。进入土壤的纳米银一部分随雨水流失，一部份转入深层土壤，在厌氧条件下转化为纳米AgS，而表层的纳米银较为稳定。本实验进行的4个月期间，土壤中人工添加的纳米银减少了一半。从平板分离的三类微生物来看，20mg/kg纳米银对土壤微生物影响较大，数量显著减少，放线菌最敏感，其次是细菌，40mg/kg纳米银影响更大。McGee等报道在10mg/kg条件下酸杆菌(Acidobacteia)下降了6%(在菌群的初始占比为15.4%)，在50mg/kg浓度土壤中下降10%。某些菌的比例会上升，比如地发菌属(Geothrix)增加了5%(初始占比为0.5%)。土壤微生物菌群结构的改变可能会影响土壤中脱氢酶、转氨酶的活性，进而影响物质转化和营养循环。

纳米银在桑树不同组织的分布呈现差异，根>叶>茎，并随土壤中浓度的增大而升高，这与卢扬等测定外源银离子在水稻中的分布趋势相同。桑树被认为具有良好的修复土壤重金属污染的能力。徐宁等报道，在赣州某地，隔、铅、铜、锌、砷超标2-8倍的作物很生长，但桑树不受影响，这些重金属能在根、茎中富集以修复土壤。在实验条件下，土壤镉含超过140mg/kg、铅含量超过200mg/kg、坤含量超过160mg/kg时桑树生长受阻，1-2年后死亡，重金属在根与茎中大量富集。在本研究中，土壤纳米银浓度超过40mg/kg就表现出明显的抑制作用，3-4个月桑树发育受阻并出现植株死亡，这可能与桑树的株龄有关，本实验采用4月龄的组培苗，抗性较弱。因此，今后可以对不同株龄的抗性差异展开研究，以便于在治理重金属污染的实践中推广应用。

纳米银抗菌作用及动物细胞毒性作用的机理研究显示，纳米银刺激产生大量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，ROS具有复杂多样的生物学功能，能破坏生物膜的完整性，损伤蛋白质、脂类及核酸，导致细胞凋亡[11]。生物已进化出不同的抗氧化机制，比如，所有生物都有硫氧还蛋白，以维持内环境的氧化-还原平衡[12]。本研究测得纳米银组桑叶中过氧化氢酶、过氧化物酶的活性显著高于对照组，就是因为纳米银所致；虽然20mg/Kg组桑叶与对照组一样没有测出纳米银，但在根与韧皮部纳米银含量高于对照组，所以叶片中两种抗氧化酶活性增高。40mg/Kg组桑树出现枯萎死亡，我们推测细胞内抗氧化能力不足以消除ROS，导致细胞死亡。