山西管涔山传统食用菌白水皮蘑菇的DNA分子鉴定

刘 虹 ，李素玲 ，董淑英 ，杨 杰 ，许 晶 ，郭福贵

（1.山西省农业科学院食用菌研究所，山西太原 030031；2.忻州市科技局，山西忻州 034000；3.宁武县农业委员会，山西宁武 036700）

白水皮是山西管涔山地区出产的一种白色、个体较小的特产蘑菇，每年夏、秋2季在华北云杉（Picea wilsonii Mast）和华北落叶松（红杄）（Larix principis-rupprechtii Mayr）林内草地上生长，散生或群生，有时形成蘑菇圈，当地百姓采食并作为土特产品出售已有数百年的历史。当地百姓通常把菇体肥大、香味浓郁的野蘑菇叫银盘，而将菌肉较薄、香味较淡的种类叫水皮，白水皮即是当地多种水皮蘑菇之一。2017年秋季，当地百姓地头出售鲜品价格约每千克20元人民币左右，是价格较低的当地野生食用菌之一。

由于白水皮在当地分布很广，出产周期长（从夏季入伏到秋季均产），而且产量较大，因而被广泛采收，是当地野生食用菌最常见的品种之一。在此之前的相关文献中[1-10]，没有发现确切的山西管涔山白水皮蘑菇对应的学术名称。

本研究首次采用ITS-DNA分子方法，对2017年采自山西管涔山林区的白水皮蘑菇进行了鉴定分析，结合子实体形态特征分析，确认其科学名称为落叶杯伞（Clitocybe phyllophila（Pers.）Kumm.），该研究结果将为山西省野生食用菌资源的研究和开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究依据的担子果样本于2017年7—8月采自山西省中北部管涔山一带的华北落叶松（Larix principis-rupprechtii Mayr） 和 华 北 云 杉（Picea wilsonii Mast）林中草地上，其具体样本信息列于表1。新鲜的担子果标本经45℃烘干后保存于山西农业科学院食用菌研究所和首都师范大学标本馆（BJTC）。

表1 研究用白水皮蘑菇样本信息

1.2 试验方法

1.2.1 形态学方法 对担子果的宏观特征在手持放大镜和体视显微镜下进行观察和描述，主要包括担子果的形状、大小、颜色、菌褶及菌柄特征等。

担子果显微结构特征观察在山西省农科院食用菌研究所微生物实验室光学显微镜下进行。首先采用手术刀进行徒手切片，以蒸馏水、3%KOH作为浮载剂制作水封片。用棉兰（cotton blue）和梅氏试剂（Melzer）检验担孢子壁有无喜兰和淀粉质反应。

1.2.2 分子方法 DNA分子研究在北京首都师范大学生命科学学院微生物实验室进行。用于本研究的样本DNA提取、PCR以及测序方法等完全采用FAN等[11-12]研究块菌属物种所使用的方法。其他用于本研究比对的DNA序列下载自NCBI数据库，本研究成功提取和测序的nrDNA-ITS序列采用BLAST软件在NCBI上进行比对，比对结果中相似性高于97%的序列用于本研究分析。

2 结果与分析

2.1 DNA-ITS比对结果

表2 白水皮蘑菇样本间ITS比对结果（BLAST） %

表3 白水皮蘑菇样本（LH0702）ITS在NCBI上BLAST结果

本研究选用2017年7—8月间由作者及团队成员采自管涔山的样本4份用于提取和测序ITS-DNA片段。将上述结果在NCBI上用BLAST工具比对，结果列于表2，3。

从表2可以看出，本研究4份样本之间ITS相似性均高于99%，可以确认这4份样本属于同一分类学物种。

2.2 分类学结果

依据采自管涔山地区4份样本的形态学特征观察，结合上述ITS分子比对结果，将这些样本定名为落叶杯伞。以下描述依据本次自行采集的、产于山西省吕梁山脉北部管涔山段的样本。

落叶杯伞为 Clitocybe phyllophila（Pers.）P.Kumm.，Führ.Pilzk.（Zerbst）：122（1871）；其同物异名 有 ：Agaricus phyllophilus Pers.，Syn.meth.fung.（Göttingen）2：457（1801）；Agaricus phyllophilus var.fuliginatus Pers.，Mycol.eur. （Erlanga）3：72（1828）；Clitocybe phyllophila f. difformis（Schumach.）Raithelh.，Metrodiana 1（1）：13（1970）；Omphalia phyllophila（Pers.）Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）var.phyllophila；Omphalia phyllophila var.pithyophila（Secr.ex Fr.）Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Omphalia phyllophila （Pers.） Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Lepista phyllophila（Pers.） Harmaja，Karstenia 15：15 （1976）；Clitocybe phyllophila var.pseudonebularis （Raithelh.）Raithelh.，Metrodiana 1 （1）：12 （1970）；Clitocybe phyllophila var.tenuis Harmaja，Karstenia 10：88 （1969）；Clitocybe phyllophila var.fusispora Raithelh.，Metrodiana 1（1）：11（1970）；Clitocybe phyllophila f.sericea Raithelh.，Metrodiana 1（1）：13（1970）；Agaricus cerussatus Fr.，Syst.mycol.（Lundae）1：92（1821）；Agaricus cerussatus var.difformis（Schumach.）Fr.，Syst.mycol.（Lundae）1：93 （1821）；Clitocybe cerussata （Fr.） P.Kumm.，Führ.Pilzk. （Zerbst）：122（1871）；Clitocybe cerussata var.difformis （Schumach.）P.Karst.，Bidr.Känn.Finl.Nat.Folk 32：64（1879）；Clitocybe cerussata var.pithyophila（Fr.）J.E.Lange,Fl.Agaric.Danic.1：79 （1935）；Omphalia cerussata （Fr.） Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Agaricus cerussatus var.obtextus（Lasch）Fr.，Epicr.syst.mycol.（Upsaliae）：62 （1838）；Omphalia cerussatavar.obtexta（Lasch）Quél.，Enchir.fung. （Paris）：22（1886）；A－garicus difformis Schumach.,Enum.pl.（Kjbenhavn）2：335 （1803）；Clitocybe difformis （Schumach.）Sacc.，Syll.fung.（Abellini） 5：154（1887）；Agaricus dilatatus Pers.，Mycol.eur. （Erlanga）3：115（1828）；Clitocybe dilatata P.Karst.，Hedwigia 28：363（1889）；Agaricus monstrosus Sowerby，Col.fig.Engl.Fung.Mushr.（London）3：tab.283（1800）；Clitocybe monstrosa Cooke，Forsch.PflKr.，Tokyo：53（1883）；Agaricus obtextus Lasch，Linnaea 3：378（1828）；Clitocybe obtexta （Lasch）Sacc.，Syll.fung. （Abellini）5：154（1887）；Agaricus pithyophilus Fr.，Epicr.syst.mycol.（Upsaliae）：62 （1838）；Clitocybe pithyophila（Fr.）Gillet，Hyménomycètes（Alençon）：152（1874）

2.3 形态学结果

担子果为小到中型（图1），菌盖初期扁半球形，光滑，无毛，边缘稍内卷，后渐平展，中部平或稍下凹，边缘整齐，老熟后或稍波浪状，无条纹，干燥，纯白色，中央部位颜色有时有点非常淡的浅黄褐色，直径2～6 cm；菌肉白色，较薄；菌褶白色，干后肉褐色或米褐色，不等长，较密，直生或近延生；菌柄较细，圆柱状或向下渐渐变细，2～8 cm长，0.3～0.8 cm粗，白色，常常水渍状，表面近平滑，常见白底色和水渍色相间形成的纵向条纹，初期中实，后中空；担孢子椭圆形，5～7 μm×3～4.5 μm，无色，表面光滑，非淀粉质。

3 讨论

从本次采集的产于山西管涔山的白水皮蘑菇提取的ITS-DNA片段在NCBI上用BLAST比对结果显示，与本研究样本相似度高于97%（同时满足查询覆盖值大于90%），并且有具体物种名称的序列有15条，涉及杯伞属Clitocybe和香蘑属Lepista共8个物种名称。从现代DNA分子系统学角度分析，这15条序列应该是同一分类学物种。这8个物种名称中，香蘑属Lepista名下有Lepista sordida，Lepista irinoides和Lepista irina var.motana等3个名称。将这3个名称基于的几条序列与有关专业论述中所引证的上述物种（或其近缘物种）序列用BLAST比对，结果显示，ITS相似度均低于94%，明显不是同种或近缘物种；从形态上看，尽管或多或少有点相似，管涔山的白水皮蘑菇与这3个物种的形态学特征明显不同[2，10，13]，由此可以推断，这 3 个名称在这里的出现可能源于所依据样本的错误鉴定。其他5个物种名称均为杯伞属Clitocybe，包括Clitocybe cerussata，Clitocybe phyllophila，Clitocybe odora，Clitocybe subditopoda 和 Clitocybe fragrans，其中，Clitocybe cerussata是 Clitocybe phyllophila的异名[13]。在这些序列中，4条Clitocybe cerussata和Clitocybe phyllophila名下的序列源自最近的专业研究分析Clitocybe，Lepista以及相关类群系统分类的论文[13-14]。因此，有理由相信，这4条欧洲序列来自真正的Clitocybe phyllophila。在此基础上，可以反推 Clitocybe odora，Clitocybe subditopoda 和 Clitocybe fragrans或源于错误的样本鉴定，或可能与Clitocybe phyllophila为同一物种。从形态学特征来分析，管涔山白水皮最为接近的种类就是Clitocybe phyllophila。

综上所述，结合形态学特征和DNA分子分析，认定产于山西省管涔山的白水皮蘑菇学名为最早报道于欧洲的落叶杯伞[10]，以前也叫白杯伞[2]，其拉丁学名为 Clitocybe phyllophila（Pers.）P.Kumm.。本研究结果是山西省第1次记录该物种。我国已有记载的分布区有吉林、内蒙古、青海、四川、云南，但是NCBI中没有该种名下中国序列，然而，3条在Lepista sordida名下来自中国但没有表明具体产地的序列（JQ293095，JQ293096，LT716070）应该源于本种。

然而，尽管DNA分子和形态学分析支持山西管涔山白水皮蘑菇与欧洲落叶杯伞为同一分类学物种，但是存在于山西北部管涔山地区的白水皮蘑菇与文献中该物种记载的最大不同是：白水皮蘑菇是管涔山一带百姓采集食用了至少上百年的传统野生食用菌，从未有过食用后中毒报告，而落叶杯伞在作者查阅的欧美和我国文献中均记载为毒菌[2，10，15-18]。已有报道显示，从落叶杯伞子实体中提取到了毒蝇碱（muscarin）[16-17]，国外也有中毒案例的报道，主要表现为毒蝇碱综合症[16]。而我国有关文献中虽然将其列为毒菌，但没有看到中毒报告或案例[18]。

管涔山当地百姓食用山上的所有种类的野蘑菇之前，都要用开水煮沸几分钟，这也许是去除某些蘑菇毒性的有效方法之一。但是据有关报道，加热煮食不会影响毒蝇碱的活性[18]，因此，目前尚无法解释这个在世界其他地区公认为有毒的蘑菇在管涔山地区为什么没有毒性反应，或者这种蘑菇在管涔山地区已经演化成落叶杯伞Clitocybe phyllophila的一个无毒的区域种群（local population），很显然，关于这个神秘的蘑菇还有很多谜团有待解开。

志谢：曹晋忠博士对本文提供有价值的意见，首都师范大学研究生闫向远、黄凯兵、陈萌、李婷、徐语言参加标本采集及部分实验工作，在此一并感谢。