桑树MaPP2-B15基因的克隆、表达与序列特征分析

杨金宏，孔卫青

（安康学院，陕西省蚕桑重点实验室，陕西安康 725000）

白粉病广泛发生在黄瓜、小麦、草莓、苹果、葡萄、甜瓜等多种作物中，患病植株的叶片散生白色细小霉斑，扩大后连成一片，布满叶背，病斑中央密生黄色小颗粒，逐渐增多，由黄色转橙红变褐，最后变成黑色，影响农业生产。黄瓜白粉病是黄瓜栽培中的常见病害之一，ZHANG等[1]（2015）在黄瓜对白粉病抗性基因的研究中发现，黄瓜Csa5M650450.1参与了该病的防御反应，该基因是拟南芥AtPP2-B15的同源基因，这是一类N端为F-box结构，C端为PP2结构的F-box蛋白（F-boxprotein，FBP），广泛存在于酵母、拟南芥、小麦、苹果等真核生物中[2-5]。

FBP是泛素连接酶的成分之一，参与植物信号转导、内噬作用、免疫、DNA修复以及蛋白降解等[2-3，6-8]。同时，PP2-B15 还与植物生长负相关，对 Cd压力敏感，可以作为Cd压力生物标记的候选[3，9-10]。番茄中PP2-B15是应对salinity压力的调节者[11]。MORANLAUTER等[12]利用铁缺陷型培养基对大豆进行处理，对参与大豆根和叶中早期缺铁黄化病的信号基因进行研究，结果发现，其与拟南芥AtPP2-B15同源基因在处理6 h后的根中表达上调。

桑里白粉病又称白背病，广泛分布于我国大多数蚕区，主要对晚秋桑叶造成危害，使桑叶提前硬化，营养下降，严重时桑叶脱落，家蚕拒食桑叶，影响正秋蚕和晚秋蚕期的养蚕生产。通过桑里白粉病被害叶不同龄期养蚕成绩的调查可知，该病叶片对幼虫生命力及茧质有较大的影响[13]。

根据已有研究对PP2-B15作用的描述，本研究利用同源克隆技术，获得了桑树中的同源基因MaPP2-B15，并对其在桑树叶片、叶柄、叶脉以及枝条桑树韧皮部组织中的表达情况进行了研究，旨在为进一步研究该基因在桑树中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料选取陕西省种植面积较大且对桑里白粉病具有一定抗性的强桑一号，取自安康学院恒口蚕桑科研基地，取新鲜叶片、叶柄、叶脉、韧皮部组织等提取总RNA。

1.2 MaPP2-B15基因的生物信息学分析与引物设计

基因信息从桑树基因组数据库网站（http://morus.swu.edu.cn/morusdb/filebrowser）的桑树同源基因数据库获取[14]，以PP2-B15为目标对功能列进行检索过滤，获得一个ID为MOPG06953的桑树同源基因，及其对应转录本L484_007289的氨基酸序列。利用该序列对桑树基因组数据库进行比对tblastn检索，获得桑树同源基因序列。primer premier 5.0 软 件 设 计 引 物 序 列 为 ：7289F：5′-ATGTTTTTACCAGAAGACTGTG-3′；7289R：5′-TGTTAGTCCTTAG-GCCTCACT-3′，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 桑树叶片RNA的提取与MaPP2-B15基因的RT-PCR扩增

植物RNA提取试剂盒（Tiangen生化科技（北京）有限公司）完成桑树叶片总RNA的提取，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解提取的总RNA，配制1.2%琼脂糖凝胶，对总RNA进行电泳，检测RNA的完整性，-70℃保存备用。

M-MLV反转录酶（北京全式金生物技术有限公司）对总RNA进行反转录，得到第1链cDNA，以此为模板，以7289F和7289R引物和NEB公司Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；最后72℃终延伸8 min。配制1.2%琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。

1.4 MaPP2-B15基因的克隆测序与序列分析

对PCR扩增产物进行回收纯化，连接pGEM-T载体（Promega）进行克隆。连接产物转化DH5大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆进行双向测序（生工生物工程（上海）有限公司）。运用sim4程序对所得基因序列的结构进行分析，序列推定蛋白的分子质量、等电点等理化性质通过在线EXPASY（http://www.expasy.org/）网站进行分析，NCBI在线BLASTP比对对序列的相似性进行分析，在线CDD预测基因编码蛋白的结构域，多重比对分析及分析结果的着色利用Clustal X 1.83软件和Boxshade（http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）网站进行。

1.5 MaPP2-B15基因的表达

提取桑树叶片、叶脉、叶柄和枝条桑树韧皮部组织的RNA，运用7289F和7289R引物进行RT-PCR扩增，扩增循环数为25，其他同1.3，1.2%的琼脂糖凝胶电泳扩增产物，EB染色。

2 结果与分析

2.1 桑树MaPP2-B15基因PCR扩增和克隆测序

以桑树叶片为材料，进行RNA提取、反转录，利用7289F，7289R引物对进行桑树MaPP2-B15基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，结果在约800 bp处获得单一条带（图1），与预期大小相符。回收该扩增条带并进行克隆测序，获得基因的序列818 bp（图 2，GenBank 登录号：MG546686）。

2.2 桑树MaPP2-B15基因序列分析

2.2.1 MaPP2-B15基因结构分析 以桑树基因组框架图为参照，运用sim4程序分析桑树MaPP2-B15基因位置结构特征，结果显示，基因有3个外显子，外显子内含子边界符合gt/ag规则（图2）。

2.2.2 桑树MaPP2-B15蛋白理化性质和结构分析MaPP2-B15基因编码271个氨基酸，其中，正电荷氨基酸残基（Arg＋Lys）31个，负电荷氨基酸残基（Asp＋Glu）38个，理论等电点（pI）5.49，是一种酸性蛋白质。分子式为C1363H2128N364O417S14，分子质量为30.735 ku。预测蛋白质的不稳定系数为43.96，是一种不稳定蛋白，脂肪系数和氨基酸残基总平均疏水系数（GRAVY）分别为79.11和-0.384，是亲水蛋白（图 3）。

预测基因编码的3～44位氨基酸为F-box结构域，94～269位氨基酸为植物韧皮部蛋白结构PP2结构域（图4），具有凝集素活性或结合RNA的特征。

在线BLASTP程序比对MaPP2-B15基因编码的氨基酸序列，与川桑（Morus notabilis）的F-box蛋白（EXB60973）一致性为97%，与核桃（Juglans regia，XP_018858311）、土瓶草（Cephalotus follicularis，GAV67823）、葡萄（Vitis vinifera，XP_002279245）、木薯（Manihot esculenta，OAY44004）、橙子（Citrus sinensis，KDO70549）、橡胶树（Hevea brasiliensis，XP_021682309）、榴莲（Durio zibethinus，XP_022719471）、毛 果 杨 （Populus trichocarpa，ERP60237）、 可 可（Theobroma cacao，EOY11556）、麻风树（Jatropha curcas，KDP38872）、蓖麻（Ricinus communis，EEF 33114）、番木瓜（Carica papaya，XP_021898946）等的F-box蛋白PP2-B15一致性在55%以上，相似性均在70%以上。多重序列比对显示，MaPP2-B15蛋白的F-box和PP2结构域在各物种间比较保守，F-box结构的保守氨基酸及其位点符合该结构的典型特征（图 5）。

2.3 MaPP2-B15基因的转录活性检测

RT-PCR对MaPP2-B15基因在桑树叶片、叶柄、叶脉和枝条韧皮部组织等中表达进行检测，电泳检测结果显示，基因在所检测的各桑树组织中均有表达（图6）。

3 结论与讨论

FBP由位于该类蛋白N端的F-box结构域和位于C端的与蛋白相互作用密切相关的结构域组成，其中，F-box结构域由大约40～50个氨基酸组成，有几个氨基酸残基比较保守，一般为L/MP（6）I/V（3）L/M（11）S/C，其他位置缺少严格的保守序列，一般采用三级结构的相应数据库来鉴定。本研究利用在线CDD预测桑树MaPP2-B15基因编码蛋白的结构域，获得其3～44位为F-box结构域。

FBP家族是拟南芥最大的超家族，不仅参与植物生长素、赤霉素、茉莉酸、乙烯等信号途径，而且还在植物发育、逆境以及植物受到不同外界环境、病原刺激和胁迫时的防御反应中发挥重要功能[2-3，15]。李彦泽[16]在对拟南芥干旱基因相关基因的研究中，获得一个受干旱诱导较明显的F-box基因AtPP2-B11。本研究桑树MaPP2-B15基因编码的94～269位氨基酸为PP2结构域，是植物韧皮部蛋白结构，具有凝集素活性或结合RNA的特征。RT-PCR技术检测MaPP2-B15基因在所调查的桑树组织器官中表达量无明显差异。植物韧皮部蛋白在植物形态维持、抵御外界物理伤害及抗病方面有较大作用[17-20]。综合本研究以及前人研究，推测桑树MaPP2-B15基因可能参与了桑树的多种生物学功能，对该基因及其功能的进一步研究也将有助于我们对桑树的生长发育及逆境生物学的了解。