KLF5在脱氧胆酸诱导胃黏膜肠上皮化生中的作用*

孙杰，付立芳

（1.山东医学高等专科学校 中医学教研室 山东 临沂 276000；2.山东省临沂市中医医院 呼吸内科，山东 临沂 276002）

胃癌的发生、发展是一个渐进过程，从正常胃黏膜、肠上皮化生、异型增生向胃癌的发生、发展进程中有多种基因的参与[1]。含有胆汁酸的胃十二指肠反流引起的胃黏膜慢性炎症，进而发生胃黏膜肠上皮化生[2]。目前有研究表明，Krüppel样因子5（Krüppellike factor 5,KLF5）在慢性胃炎和肠上皮化生的表达与正常对照组相比，呈上升趋势[3-4]。因此，本文通过脱氧胆酸（deoxycholic acid,DCA）诱导胃黏膜上皮细胞，探究KLF5是否参与DCA诱导的肠上皮化生的发生及其可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

胃黏膜上皮细胞GES-1（中国科学院上海细胞库）。选取山东省临沂市中医医院2012～2015年的56例胃黏膜标本，其中30例正常胃黏膜，26例肠上皮化生。本研究经本院医学伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。鼠抗KLF5、TFF2、VIL1、CDX2、Wnt3a、β-catenin、多克隆抗体、β-actin鼠抗单克隆抗体、羊抗鼠二抗（HRP）购自英国Abcam公司，MTT、二甲基亚砜、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，流式细胞仪（美国BD公司）。

1.2　方法

1.2.1正常胃黏膜和肠上皮化生组织的选取正常胃黏膜30例，其中，男性13例，女性17例；肠上皮化生26例，其中，男性16例，女性10例。以上组织均置于-80℃中保存，用于提取蛋白和mRNA。

1.2.2胃黏膜上皮细胞的培养和转染GES-1细胞在含10%胎牛血清、100μ/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养，置于37℃、5%二氧化碳CO2孵箱中生长。将细胞分为两组，应用1 mol/L氯化氢调定培养基pH值至7.2，采用不同浓度（100、200和500μmol/L）的DCA处理细胞12 h，置于37℃、5% CO2孵箱中孵育。空白对照组为不含DCA的RPMI 1640培养液，继续培养12 h。

1.2.3细胞转染将GES-1细胞分为空白对照组、DCA组、阴性对照组及KLF5沉默组。细胞长至50%～60%密度时，分别将KLF5 siRNA和阴性序列对照按50 nmol/L浓度转染GES-1细胞，24 h后更换为不含双抗的RPMI 1640培养液，并加入500μmol/L DCA或者溶剂对照（Veh）处理细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h，观察细胞感染情况。用Western blot检测验证KLF5沉默的效率。

1.2.4MTT法MTT法检测细胞增殖。按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）清洗后加入MTT，37℃温育4 h，加入二甲基亚砜150μl/孔，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解，用酶标仪在570 nm处测吸光度值。

1.2.5流式细胞术按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，PBS清洗，参照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书，在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

1.2.6Western blot检测分别取正常胃黏膜、肠上皮化生组织，以及DCA处理GES-1细胞样品，提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭，4℃条件下用抗KLF5、Wnt3a和β-actin（均为1∶300）的一抗孵育过夜，PBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用增强化学发光法发光液在暗室曝光并压片。将GES-1细胞分为空白对照组、DCA组、阴性对照组及KLF5沉默组，按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，按照上述方法检测TFF2、VIL1和CDX2蛋白的表达。将GES-1细胞分为空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、氯化锂LiCl（Wnt通路激活剂）组及LiCl+KLF5沉默组，按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，按照上述方法检测Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白的表达。

1.2.7实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分别取正常胃黏膜、肠上皮化生组织，以及DCA处理GES-1细胞样品。采用Trizol法分别提取总RNA，并检测其纯度及完整性。按照逆转录试剂盒说明书生成cDNA，扩增cDNA，基因扩增成功后，采用2-△△Ct法，对KLF5和Wnt3a的含量进行分析。将GES-1细胞分为空白对照组、DCA组、阴性对照组及KLF5沉默组，按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，按照上述方法检测TFF2、VIL1和CDX2 mRNA的表达。将GES-1细胞分为空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组，按分组收集转染48 h后的GES-1细胞，按照上述方法检测Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA的表达。

1.3　统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　KLF5和Wnt3a在肠上皮化生组织中异常表达

2.1.1KLF5和Wnt3a蛋白肠上皮化生组织中KLF5和Wnt3a蛋白相对表达量分别为（2.37±0.06）和（2.32±0.07）；正常胃黏膜中KLF5和Wnt3a蛋白相对表达量分别为（1.02±0.08）和（1.00±0.07）。两组KLF5和Wnt3a蛋白表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（t=80.350和98.002，均P=0.000），肠上皮化生组织中KLF5和Wnt3a蛋白表达升高。见图1。

图1　正常胃黏膜和肠上皮化生组织中KLF5、Wnt3a蛋白的表达（±s）

2.1.2KLF5和Wnt3a mRNA肠上皮化生组织中KLF5和Wnt3a mRNA相对表达量分别为（2.14±0.06）和（2.22±0.07）；正常胃黏膜中KLF5和Wnt3a mRNA相对表达量分别为（1.00±0.06）和（1.00±0.08）。两组KLF5和Wnt3a mRNA表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（t=70.910和70.817，均P=0.000），肠上皮化生组织中KLF5和Wnt3a mRNA表达升高。见图2。

图2　正常胃黏膜和肠上皮化生组织中KLF5和Wnt3a mRNA表达水平比较（±s）

2.2　DCA诱导GES-1细胞中KLF5和Wnt3a的表达

2.2.1KLF5和Wnt3a蛋白100、200和500μmol/L DCA组，以及空白对照组的KLF5蛋白相对表达量分别 为（1.26±0.07）、（1.63±0.06）、（2.47±0.06） 和（1.00±0.06）；100、200和 500μmol/L DCA 组，以及空白对照组的Wnt3a蛋白相对表达量分别为（1.20±0.07）、（1.59±0.09）、（2.34±0.08）和（1.00±0.07）。各组细胞中KLF5和Wnt3a蛋白表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=268.043和143.273，均P=0.000），随着DCA浓度增加，GES-1细胞中KLF5和Wnt3a的表达水平逐渐升高。见图3。

2.2.2KLF5和 Wnt3a mRNA100、200和 500μmol/L DCA组，以及空白对照组的KLF5 mRNA相对表达量分别为（1.24±0.08）、（1.74±0.06）、（2.21±0.06）和（1.00±0.05）；100、200 和 500μmol/L DCA 组，以及空白对照组的Wnt3a mRNA相对表达量分别为（1.20±0.05）、（1.73±0.08）、（2.28±0.07）和（1.00±0.06）。各组细胞中KLF5和Wnt3a mRNA表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=179.614和209.881，均P=0.000），KLF5和Wnt3a mRNA表达水平呈剂量依赖效应。KLF5和Wnt通路可能在胃黏膜肠上皮化生中发挥重要作用。见图4。

图3　不同浓度DCA对GES-1细胞中KLF5和Wnt3a蛋白表达的影响（±s）

图4　不同浓度DCA对GES-1细胞中KLF5和Wnt3a mRNA 表达的影响（±s）

2.3　KLF5沉默抑制DCA诱导的GES-1细胞增殖并促进凋亡

2.3.1KLF5蛋白空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的KLF5蛋白相对表达量分别为（1.00±0.06）、（2.45±0.08）、（2.36±0.06）和（0.11±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=822.422，P=0.000），si-KLF5转染后，细胞中KLF5蛋白表达降低。见图5。

图5　各组GES-1细胞中KLF5蛋白的表达（±s）

2.3.2增殖率空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组GES-1细胞增殖率分别为（100.00±3.46）%、（125.00±3.60）%、（123.00±3.60）% 和（102.00±4.58）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=36.136，P=0.000），DCA促进GES-1细胞增殖，而将KLF5沉默后，DCA的促增殖作用被抑制。见图6。

图6　各组GES-1细胞增殖率比较（±s）

2.3.3凋亡率空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组GES-1细胞凋亡率分别为（18.70±0.72）%、（10.30±0.70）%、（9.80±0.79）%和（17.80±0.79）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=119.419，P=0.000），DCA 抑制GES-1细胞凋亡，而KLF5沉默后，DCA的抑制凋亡作用被抑制。DCA可能通过KLF5影响GES-1细胞的增殖和凋亡。见图 7、8。

图7　各组GES-1细胞凋亡情况

图8　各组GES-1细胞凋亡率比较（±s）

2.4　KLF5沉默抑制DCA诱导的GES-1细胞肠上皮化生

2.4.1TFF2、VIL1和CDX2蛋白空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的TFF2蛋白相对表达量分别为（1.00±0.05）、（2.46±0.08）、（2.38±0.09）和（1.09±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=301.250，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的VIL1蛋白相对表达量分别为（1.00±0.05）、（2.39±0.09）、（2.37±0.07）和（1.11±0.05），经方差分析，差异有统计学意义（F=385.109，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的CDX2蛋白相对表达量分别为（1.00±0.06）、（2.52±0.08）、（2.51±0.09）和（1.02±0.05），经方差分析，差异有统计学意义（F=413.707，P=0.000）。DCA升高TFF2、VIL1和CDX2蛋白表达水平，而KLF5沉默后DCA的作用被抑制。见图9。

2.4.2TFF2、VIL1和CDX2 mRNA空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的TFF2 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.05）、（2.35±0.05）、（2.37±0.06）和（1.11±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=418.568，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的VIL1 mRNA相对表达量分别为（1.02±0.03）、（2.32±0.05）、（2.29±0.05）和（1.10±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（531.171，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组的CDX2 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.04）、（2.41±0.08）、（2.43±0.05）和（1.05±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=452.901，P=0.000）。DCA 升 高 TFF2、VIL1和CDX2 mRNA表达水平，而KLF5沉默后DCA的作用被抑制。DCA可能通过KLF5诱导胃黏膜肠上皮化生。见图10。

图9　各组GES-1细胞中TFF2、VIL1和CDX2 蛋白的表达（±s）

图10　各组GES-1细胞中TFF2、VIL1和CDX2 mRNA表达水平比较（±s）

2.5　KLF5促进DCA诱导的GES-1细胞肠上皮化生

2.5.1Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的Wnt3a蛋白相对表达量分别为（1.01±0.06）、（2.38±0.06）、（2.26±0.05）、（1.02±0.05）、（2.36±0.08） 和（2.32±0.08）， 经 方差分析，差异有统计学意义（F=320.400，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的β-catenin蛋白相对表达量分别为（0.98±0.06）、（2.32±0.07）、（2.31±0.07）、（1.08±0.07）、（2.33±0.08） 和（2.40±0.07）， 经 方差分析，差异有统计学意义（F=266.022，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的CDX2蛋白相对表达量分 别 为（1.02±0.06）、（2.48±0.06）、（2.34±0.08）、（1.02±0.08）、（2.37±0.05） 和（2.38±0.06）， 经 方差分析，差异有统计学意义（F=312.093，P=0.000）。DCA激活Wnt通路Wnt3a、β-catenin，以及肠上皮化生标志蛋白CDX2蛋白的表达，将KLF5沉默后，Wnt通路蛋白和肠上皮化生标志蛋白表达下降，而Wnt激活剂则使抵消了si-KLF5的作用，激活Wnt通路并升高CDX2的表达。见图11。

图11　Wnt激动剂对si-KLF5调节GES-1细胞中Wnt3a、β-catenin和CDX2蛋白表达的影响（±s）

2.5.2Wnt3a、β-catenin 和 CDX2 mRNA空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的Wnt3a mRNA相对表达量分别为（1.00±0.06）、（2.32±0.07）、（2.28±0.06）、（1.09±0.06）、（2.26±0.06）和（2.23±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=310.259，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的β-catenin mRNA相对表达量分别为（1.00±0.05）、（2.29±0.06）、（2.25±0.08）、（1.11±0.09）、（2.21±0.08）和（2.20±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=190.732，P=0.000）；空白对照组、DCA组、阴性对照组、KLF5沉默组、LiCl组及LiCl+KLF5沉默组的CDX2 mRNA相对表达量分别为（1.00±0.03）、（2.31±0.06）、（2.26±0.06）、（1.05±0.04）、（2.27±0.06）和（2.25±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=400.107，P=0.000）。DCA激活Wnt通路Wnt3a、β-catenin，以及CDX2 mRNA的表达，将KLF5沉默后，Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA表达下降，而Wnt激活剂则使抵消了si-KLF5的作用，激活Wnt通路并升高CDX2 mRNA的表达。KLF5可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进DCA诱导的胃黏膜肠上皮化生。见图12。

图12　Wnt激动剂对si-KLF5调节GES-1细胞中Wnt3a、β-catenin和CDX2 mRNA表达的影响（±s）

3　讨论

我国是胃癌高发国家，每年新发病例占全世界发病人数的绝大多数。决定胃癌患者预后的关键在于早期发现、诊断和治疗。慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生及异型增生是重要的胃黏膜癌前病变[5-6]。因此，胃黏膜肠上皮化生发病机制的研究，可为胃黏膜异型增生甚至癌变的治疗提供新思路。

Krüppel样基因家族（Krüppel like factor,KLFs）为哺乳类动物的转求调节因子，属于锌指蛋白转录因子家族。其中KLF5又称为BTEB2和IKLF，属于KLF家族[7]。KLF5在不同组织不同层次中有广泛的表达。作为一个基本的转录因子，KLF5在细胞周期调控、细胞凋亡、迁移和分化中发挥必不可少的作用。另外，KLF家族成员KLF2、KLF4、KLF5及KLF8均证实作为致癌因子，促进各种癌症的发生、发展[8-10]。有研究证明，KLF5协同其他转录因子促进胃癌的发展[11]，而其在癌前病变中的作用并无相关报道。有研究表明，DCA可以诱导食管癌的癌前病变[2]。因此，本文用DCA诱导胃黏膜细胞，观察KLF5沉默对胃黏膜肠上皮化生的作用。本实验结果证明，与正常胃黏膜相比，KLF5在肠上皮化生中的表达升高，提示KLF5可能在胃黏膜肠上皮化生中发挥重要作用。进一步实验结果表明，与正常胃黏膜上皮细胞相比，DCA诱导胃黏膜肠上皮化生细胞模型中KLF5的表达升高。

细胞增殖和凋亡是保持机体平衡和修复损伤的重要因素。胃黏膜上皮细胞更新非常迅速，研究认为肠上皮化生的发生是细胞异常增生逐渐积聚的结果[12]。有研究表明，抑制KLF5能够减轻口腔黏膜癌前病变[13]。KLF5能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而促进癌症的发展[14]。本实验结果表明，DCA促进GES-1细胞的增殖，并抑制凋亡，而KLF5沉默后抑制DCA对细胞增殖、凋亡的影响。

同源异形盒基因CDX2是一种肠上皮特异性转录因子，可控制肠上皮细胞的分化和成熟，在肠上皮化生黏膜中呈高表达[15]。三叶因子家族（trefoil factor family,TFF）是胃肠道黏液细胞分泌的具有≥1个三叶结构域的小分子蛋白质多肽，主要功能是保护黏膜、促进损伤黏膜修复。研究发现，在TFF2缺陷小鼠模型实验中，小鼠的胃黏膜增生降低，提示TFF2可能有刺激胃黏膜增殖的作用，增加胃癌发生的危险性[16]。绒毛蛋白（Villin,VIL）是一种重要的细胞支架蛋白，在刷状缘上皮细胞分化过程中发挥重要作用。近年来研究表明，VIL1是肠上皮细胞分化和转移性肠腺癌的标志物，可以辅助明确转移性肿瘤的来源[17]。因此，TFF2、VIL1和CDX2作为肠上皮化生的标志蛋白，在肠上皮化生过程中发挥重要作用。越来越多的研究表明，Wnt信号通路除参与调控发育过程外，在癌症的发展中也发挥重要作用。Wnt途径激活后，相关的细胞周期和凋亡相关基因、生长因子和黏附分子等开始转录，参与癌症的发生、发展[18]。有研究表明，KLF5敲除的小鼠中Wnt通路被抑制，肠上皮稳态被破坏[19]。本实验结果表明，KLF5沉默抑制DCA对TFF2、VIL1和CDX2的上调作用；另外，在Wnt通路干预后，si-KLF5的作用又被抑制，表明KLF5可能通过Wnt/β-catenin通路促进DCA诱导的肠上皮化生。

综上所述，本文通过DCA诱导胃黏膜上皮细胞，发现KLF5沉默明显抑制DCA诱导的胃黏膜上皮细胞肠上皮化生，表明KLF5可能促进DCA诱导的肠上皮化生，其机制可能是通过激活Wnt/β-catenin通路来实现的。本研究指出KLF5参与DCA诱导的胃黏膜肠上皮化生的发生，为预防胃癌提供新的靶点。