温针灸对神经痛大鼠脊髓白细胞介素—6及细胞信号转导抑制因子3的影响

俞向梅　杨意州　刘建波　李长征　龚德贵　王志福

摘要：目的 观察温针灸对神经痛大鼠脊髓白细胞介素-6（IL-6）、细胞信号转导抑制因子3（SOCS3）的影响，探讨其治疗神经痛的作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、温针组、IL-6组，每组6只。模型组建立坐骨神经慢性限制性损伤神经痛模型，不干预；温针组造模成功第5日后，选取“脾俞”“肾俞”温针灸治疗，共10次；IL-6组造模成功第5日起，脊髓鞘内注射重组IL-6，共3次。电子触觉测量机械痛行为学，ELISA和RT-PCR检测脊髓IL-6、SOCS3 mRNA及小胶质细胞活化标记物Iba-1的表达。结果 与模型组比较，温针组机械痛阈值明显升高（P<0.01），Iba-1含量明显降低（P<0.01），脊髓背角IL-6 mRNA表达明显降低（P<0.01），SOCS3 mRNA表达明显升高（P<0.01）。结论 温针灸能减轻神经痛大鼠痛敏反应，其机制可能与抑制脊髓小胶质细胞活化、下调IL-6表达和上调SOCS3表达有关。

关键词：神经病理性疼痛；温针灸；脊髓；白细胞介素-6；细胞信号转导抑制因子3；神经炎症；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.014

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0064-04

Abstract： Objective To observe effects of warming acupuncture therapy on expressions of IL-6 and SOCS3 in spinal cord in rats with neuropathic pain； To discuss its mechanism for treating neuropathic pain. Methods Experimental rats were randomly divided into： normal group， model group， warming acupuncture and IL-6 group， with 6 rats in each group. Sciatic nerve chronic constriction injury neuralgia model was established in the model group， without intervention. After modeling for 5 days in the warming acupuncture group， “Pishu” and “Shenshu” acupoints were chosen for warming acupuncture therapy for 10 times. After modeling for 5 days in the IL-6 group， IL-6 group was successfully intrathecally injected 3 times with recombinant IL-6. After finishing all experiments， the mechanical pain behavior was measured with electronic Frye fibers. The mRNA levels of IL-6 and SOCS3 and protein concentration of spinal Iba-1were detected with ELISA and RT-PCR analysis. Results Compared with model group， mechanical withdrawal thresholdsin the warm acupuncture group significantly increased， and the content of Iba-1 decreased significantly （P<0.01）； The mRNA level of IL-6 decreased significantly （P<0.01）， and the mRNA level of SOCS3 significantly increased （P<0.01）. Conclusion Warming acupuncture therapy can reduce the pain response in rats with neuropathic pain through inhibiting spinal cord microglial activation， down-regulating the gene expression of lL-6 and up-regulating the gene expression of SOCS3.

Keywords： neuropathic pain； warming acupuncture therapy； spinal cord； IL-6； SOCS3； nerve inflammation； rats

神經病理性疼痛（简称“神经痛”），是由躯体感觉神经系统的损伤或相关疾病而造成的疼痛。按国际上神经痛发病率约8%推算，中国约有0.9亿神经痛患者。有研究显示，温针灸脾俞、肾俞有健脾益肾、活血化瘀的功效，对各种神经痛具有明显的镇痛作用[1-3]。本课题组前期研究表明，神经痛发生时，脊髓中枢出现明显的神经炎症现象，且与脊髓白细胞介素（IL）-6、细胞信号转导抑制因子3（SOCS3）表达存在密切联系[4-5]。本实验观察温针灸对神经痛大鼠机械痛敏反应及IL-6、SOCS3表达的影响，探讨其治疗神经痛的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠24只，5～6周龄，体质量200～220 g，上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于福建中医药大学SPF级实验动物中心，分笼适应性喂养1周，将大鼠称重并编号。所有实验均遵照国际动物保护和使用指南的规定实施。

1.2 主要试剂与仪器

4-0铬制羊肠线，上海浦东金环医疗用品股份有限公司；华佗牌一次性针灸针（0.28 mm×15 mm）、清艾条，苏州医疗用品厂有限公司；Recombinant Rat IL-6（货号400-06），美国PeproTech（派普泰克）公司；IL-6、SOCS3、GAPDH引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IQ5多重实时荧光定量PCR仪器，美国Bio-Rad公司；38450-电子触觉测量仪（电子Von Frey），意大利Ugo Basile公司。

1.3 分组及造模

采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、温针组和IL-6组，每组6只。模型组建立坐骨神经慢性限制性损伤（CCI）神经痛模型，不干预；温针组造模成功第5日起，选取“脾俞”“肾俞”温针灸治疗，每日1次，共10次；IL-6组造模成功第5日起，脊髓鞘内注射重组IL-6，共3次。参考文献[4-5]方法制作CCI神经痛模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，右侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，在坐骨神经中段用4-0铬制羊肠线松扎四道，致CCI神经痛大鼠模型，术后用青霉素粉末预防感染。模型建立后，术后第5、14日观察实验大鼠机械痛行为学变化。

1.4 温针灸干预

针灸穴位参照大鼠穴位图谱[6]，取双侧“脾俞”（大鼠第12胸椎旁开7 mm）、双侧“肾俞”（大鼠第2腰椎旁开7 mm）温针灸治疗。安静环境、室温（20±2）℃，将大鼠躯干固定于木架上，头部与四肢可自由活动，静置20 min，将一次性针灸针刺入穴位，针刺后在针尾上搓捏少许艾绒点燃施灸，只待燃尽，除去灰烬，留针30 min后取针。正常组自由饮食活动，不进行任何干预。

1.5 鞘内注射白细胞介素-6

大鼠取俯卧位，实验者食指定位于大鼠脊柱L5-6间隙，右手持微量注射器从间隙垂直缓慢进针，以大鼠尾巴出现颤动或突然的侧向甩动作为穿刺成功的标志，注入相应药物。在第5、10、14日，鞘内注射20 ng/μL重组IL-6溶液，10 μL/次。

1.6 观察指标

1.6.1 机械痛行为测试

测试环境为10 cm×20 cm×20 cm有机玻璃笼，将大鼠放入笼内静置10 min，采用电子Von Frey法进行检测，即利用不同強度的纤毛刺激大鼠足掌中心部位，引起大鼠缩爪反应。最小能引起缩爪反应的纤毛压力即为大鼠的缩爪反应阈值（g），以此反应大致的机械痛敏情况。

1.6.2 脊髓小胶质细胞标记物Iba-1、白细胞介素-6、细胞信号转导抑制因子3检测

第14日全部实验结束后，迅速新鲜取材脊髓（L4-5节段）背角置于液氮中，-80 ℃冰箱保存待测。

ELISA检测脊髓小胶质细胞标记物Iba-1表达。①取脊髓背角组织匀浆离心，提取上清液；②96孔酶标板上加样，每孔加入标准品或待测样品100 μL，将反应板混匀后置37 ℃ 40 min；③用洗涤液将反应板洗涤4～6次，滤纸上印干；④每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外）。将反应板混匀后置37 ℃ 20 min；⑤按步骤③再次洗板；⑥每孔加酶标抗体工作液100 μL。将反应板置37 ℃ 10 min，如前步骤再次洗板；⑦每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min；⑧每孔加入100 μL终止液混匀，30 min内于酶标仪450 nm处测吸光度，画出标准曲线，根据样品OD值计算出相应Iba-1含量。

RT-PCR检测脊髓SOCS3、IL-6 mRNA表达。组织总RNA提取：冰浴取出新鲜脊髓背角组织，每50～100 mg组织加1 mL Trizol试剂，冰浴超声匀浆15～20 s；每1 mL Trizol试剂加0.2 mL氯仿，快速震荡15 s，冰浴5 min，4 ℃、12 000×g离心15 min；加与水等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，冰浴15 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清，吸干异丙醇；加75%乙醇，重悬沉淀，4 ℃、7500×g离心8 min，弃上清，消毒滤纸上吸干乙醇；重复以上步骤，倾去乙醇，空气干燥；干燥后将沉淀溶于DEPC水，置70 ℃贮存，沉淀加乙醇于20 ℃可长期贮存；取4 μL总RNA溶液稀释至1 mL，紫外分光光度计检测OD260和OD280值，测定其浓度和纯度。反转录合成cDNA第一链：PCR管中依次加入Total RNA、Oligo（dT）15 primer、DEPC H2O（Rnase-free），70 ℃变性5 min，冰浴5 min；随后加入5×M-MLV Reaction buffer、10 mmol/L dNTPs、RNase inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、DEPC H2O，37 ℃水浴60 min，95 ℃水浴5 min， 冰浴5 min。PCR扩增：PCR管依次加入2×Taq PCR Master Mix、Sense primer、Antisense primer、反转录产物、dd H2O，混匀，瞬时离心。94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min；实时荧光定量PCR仪进行样本分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，符合正态分布用方差分析，不符合正态分布用秩和检验中独立样本比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 温针灸对模型大鼠机械痛行为的影响

与正常组比较，模型组大鼠造模后第5、14日，机械痛阈值明显降低（P<0.01）；造模后第14日与模型组比较，温针组大鼠机械痛阈值明显升高（P<0.01），IL-6组大鼠机械痛阈值明显降低（P<0.01）。结果见图1。

2.2 温针灸对模型大鼠脊髓小胶质细胞标记物Iba-1的影响

术后第14日，与正常组比较，模型组大鼠脊髓Iba-1含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，温针组大鼠脊髓Iba-1含量显著降低（P<0.01），IL-6组大鼠脊髓Iba-1含量显著升高（P<0.01）。结果见图2。

2.3 温针灸对模型大鼠脊髓白细胞介素-6、细胞信号转导抑制因子3 mRNA表达的影响

术后第14日，与正常组比较，模型组大鼠脊髓IL-6、SOCS3 mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，温针组大鼠脊髓IL-6 mRNA表达显著降低，SOCS3 mRNA表达显著升高（P<0.01），IL-6组大鼠脊髓IL-6 mRNA表达显著升高（P<0.01），SOCS3 mRNA表达显著降低（P<0.01）。结果见图3。

3 讨论

神经痛可归属中医学“痹证”范畴。灸法是一种温热刺激，有温经散寒、扶阳固脱、活血化瘀的功效，正如《灵枢·官能》“针所不为，灸之所宜”。肾俞为肾的背俞穴，具有疏经益气、补肾益精作用；脾俞为脾之背俞穴，具有健脾益气通络作用。大鼠脾俞、肾俞解剖深层邻近肾上腺免疫器官，针灸肾上腺邻近背俞穴（脾俞、肾俞），刺激相应节段交感神经纤维，可影响神经递质或激素释放，调节机体免疫功能。

在神经痛的发生及发展中，外周神经损伤刺激达一定阈值时，脊髓胶质细胞激活可释放炎性因子（IL-6、IL-1β等），参与维持脊髓中枢敏化状态，并出现“神经炎症”现象[7-8]。SOCS3作为SOCS家族蛋白中的重要一员，在周围神经损伤及神经炎症中发挥重要的作用；坐骨神经损伤SOCS3表达不断升高，抑制周围神经巨噬细胞的聚集；IL-6作为多功能细胞因子，参与炎症及神经痛的发生发展过程[9-10]。SOCS3作为IL-6信号通路的首要抑制剂，可通过结合IL-6受体亚基gp130或JAKs蛋白，从而抑制炎症反应[11-12]。有研究显示，神经痛发生时，CCI大鼠脊髓小胶质细胞显著激活，脊髓IL-6表达显著上调，应用小胶质细胞抑制剂米诺环素可显著抑制IL-6表达，减轻机械痛觉过敏[13]。此外，小胶质细胞高表达SOCS3蛋白可抑制JAK/STAT3信号通路，降低IL-6表达，减轻神经炎症反应[14]。

前期研究表明，在CCI大鼠中，SOCS3存在于小胶质细胞中，电针可抑制脊髓胶质细胞活化，并进一步上调胶质细胞中SOCS3表达水平，并反馈性抑制IL-6细胞因子释放，发挥抗炎镇痛作用[5]。本实验结果也显示，神经痛发生时，脊髓小胶质细胞显著激活，脊髓IL-6表达显著上调，鞘内注射IL-6可降低SOCS3 mRNA表达，进一步加剧痛敏反应；温针灸效果类似电针，可显著抑制脊髓小胶质细胞的活化，上调脊髓SOCS3 mRNA表达，降低脊髓IL-6释放，从而减轻机械痛敏反应。

综上所述，温针灸“脾俞”“肾俞”能减轻CCI大鼠机械痛敏化反应，可能与降低脊髓神经炎症、促进脊髓SOCS3表达有关，但其具体作用机制有待于今后深入研究。

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（收稿日期：2017-09-22）

（修回日期：2017-10-25；編辑：华强）