杜仲皮、杜仲雄花醇提取物对模型小鼠气道变应性炎症的影响

王健英　陈晓俊　张磊　王凯　侯剑伟　符胜光　潘颖宜　袁颖

摘要：目的 觀察杜仲皮、杜仲雄花醇提物对鸡卵清蛋白（OVA）所致小鼠气道变应性炎症的影响，探讨其作用机制。方法 实验第0、7日，OVA腹腔注射致敏，继而滴鼻激发21 d，建立小鼠气道变应性炎症模型。实验小鼠随机分为正常组、模型组、杜仲皮醇提物组（杜仲皮组）、杜仲雄花醇提物组（杜仲雄花组）和地塞米松组，各给药组给予相应药物灌胃。肺组织行HE、PAS染色，观察支气管及周围肺组织病理改变，ELISA检测小鼠血清OVA-IgE、白细胞介素（IL）-4、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-13水平，免疫组化检测小鼠肺组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）表达，流式细胞术检测小鼠外周血Th17+细胞表达，RT-PCR检测小鼠肺组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6 mRNA表达。结果 模型组小鼠肺组织可见嗜酸性粒细胞及其他炎症细胞浸润，支气管痉挛，黏液分泌增加，杜仲皮组和杜仲雄花组小鼠肺组织病理明显改善。与正常组比较，模型组小鼠血清OVA-IgE、IL-4、IL-13水平升高，IFN-γ水平降低（P<0.05，P<0.01），肺组织ICAM-1、VEGF、MMP9表达增强，TIMP1表达降低（P<0.01），外周血IL-17+细胞增加，肺组织TNF-α、IL-6 mRNA表达均升高（P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组和杜仲雄花组小鼠血清OVA-IgE、IL-4、IL-13水平明显下调（P<0.01），ICAM-1、VEGF表达明显下调（P<0.05，P<0.01），TIMP1表达升高，外周血IL-17+细胞降低，肺组织IL-6 mRNA表达降低（P<0.05，P<0.01），杜仲皮组还可诱导IFN-γ分泌（P<0.01），下调TNF-α mRNA表达（P<0.05），杜仲雄花组MMP9表达明显下调（P<0.05）。结论 杜仲皮、杜仲雄花醇提物可能通过降低模型小鼠OVA-IgE产生，抑制Th2类细胞因子分泌，下调Th17细胞，抑制促炎细胞因子表达，对气道变应性炎症有一定抑制作用。

关键词：杜仲皮；杜仲雄花；气道变应性炎症；细胞因子；黏附分子；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.010

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0042-06

Abstract： Objective To investigate the effects of alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. on airway allergic inflammation induced by chicken ovalbumin （OVA） in mice； To explore its mechanism of action. Methods On day 0， day 7， mice were intraperitoneally injected OVA for sensitization， followed by nasal stimulation for 21 days to establish airway allergic inflammation mice models. The mice were divided into normal group， model group， alcohol extract of bark of Eucommia ulmoides Oliv. group， alcohol extract of male flower of Eucommia ulmoides Oliv. group， and Dexamethasone group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The lung tissue was embedded in HE and PAS dyeing， to observe the pathological changes of bronchus and

surrounding lung. The levels of serum OVA-IgE， IL-4， IFN-γ and IL-13 were measured by ELISA. The expression of ICAM-1， VEGF， MMP9 and TIMP1 were detected by immunohistochemistry. Flow cytometry was used to detect the expression of Th17 cells in peripheral blood. The expressions of TNF-α and IL-6 mRNA in lung tissue were detected by RT-PCR. Results The model group showed changes of airway allergic inflammatory such as eosinophils and other inflammatory cell infiltration， bronchial spasm， and mucus secretion. Lung histopathology in alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. groups was improved significantly （P<0.05）. Compared with the normal group， the levels of serum OVA-IgE， IL-4 and IL-13 increased in model group， while the level of IFN-γ decreased （P<0.05， P<0.01）. The expressions of ICAM-1， VEGF and MMP9 increased， while the expression of TIMP1 decreased （P<0.01）； peripheral blood IL-17+cells increased （P<0.01）； the expressions of TNF-α and IL-6 mRNA increased. Compared with the model group， the levels of serum OVA-IgE， IL-4 and IL-13 decreased in alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. groups （P<0.05， P<0.01）； the expressions of ICAM-1 and VEGF decreased （P<0.05， P<0.01）； the expression of TIMP1 increased. Alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. could down-regulate IL-17+cells， reduce the expression of IL-6 mRNA （P<0.05， P<0.01）. Alcohol extract of bark of Eucommia ulmoides Oliv. group could induce the secretion of IFN-γ （P<0.01）， and down-regulate the expression of TNF-α mRNA （P<0.05）. Alcohol extract of male flower of Eucommia ulmoides Oliv. group could significantly down-regulate the expression of MMP9 （P<0.05）. Conclusion Alcohol extract of bark and male flower of Eucommia ulmoides Oliv. can induce the production of OVA-IgE， inhibit secretion of Th2 cytokines， inhibit the expression of adhesion molecules， depress Th17 cells， so as to inhibit the airway allergic inflammation.

Keywords： bark of Eucommia ulmoides Oliv.； male flower of Eucommia ulmoides Oliv.； airway allergic inflammation； cytokines； adhesion molecules； mice

杜仲Eucommia ulmoides Oliv.属杜仲科植物，是我国特有植物，杜仲传统药用部位为树皮，具有补肝肾、强筋骨的功效，用于肝肾不足之腰膝酸痛、筋骨无力。杜仲雄花目前多作为花茶应用，有研究显示，其具有良好的镇静催眠及抗氧化、抑菌作用[1-2]。前期研究表明，杜仲皮、杜仲雄花均有一定的抗炎、调节免疫、镇痛、抑菌等作用[3]。气道变应性炎症反应属于Ⅰ型变态反应，临床主要表现为变应性鼻炎和支气管哮喘。本研究观察杜仲皮、杜仲雄花对鸡卵清蛋白（OVA）所致小鼠气道变应性炎症模型的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性Balb/c小鼠50只，SPF级，6周龄，体质量（20±2）g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物合格证号SCXK（沪）2013-0016。分笼饲养于上海中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室。

1.2 药物及制备

杜仲皮购自上海康桥饮片厂，批号201601103，杜仲雄花购自湖北张家界，经上海中医药大学生药教研室吴靳荣副教授鉴定，实验所用样品分别为杜仲科植物杜仲的干燥皮、雄花的干燥品。分别取杜仲皮、杜仲雄花各100 g。适当粉碎，加8倍量70%乙醇加热回流提取，减压浓缩后干燥备用。醋酸地塞米松片，天津力生制药有限公司，0.75 mg/片，批号14011232。

1.3 主要試剂与仪器

OVA（V级），美国Sigma公司；氢氧化铝凝胶，美国Sigma；ELISA试剂盒（即用型），美国Peprotech公司；一抗：细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管内皮生长因子（VEGF），美国Abcam公司；基质金属蛋白酶（MMP）9，美国Abcam公司；组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP1），美国Abcam公司；EnVision试剂（HRP/Rabbit）即用型，丹麦Dako公司；Anti-Mouse 白细胞介素（IL）-17A FITC，eBioscience；RT-PCR试剂盒，日本Takara Bio公司。Synergy HT多功能酶标仪，Biotek；全自动轮转式石蜡切片机型号RM2265，Leica公司；显微镜DMM-300D，上海蔡康光学仪器有限公司；流式细胞仪，Becton Dickinson Facscalibour公司；Applied Biosystems?的PCR热循环仪，美国ABI公司。

2 实验方法

2.1 造模及分组

于实验第0日，实验小鼠分别腹腔注射200 μL 1%OVA+氢氧化铝凝胶[100 μgOVA+100 μL Al（OH）3]。第7日加强免疫1次。随机分为正常对照组、模型组、杜仲皮醇提物组（杜仲皮组）、杜仲雄花醇提物组（杜仲雄花组）、地塞米松组，每组10只。于实验第14日开始，用微量移液器给小鼠滴鼻2%OVA生理盐水溶液（200 μg OVA+100 μL生理盐水）20 μL/只激发，隔日1次，连续21 d。

2.2 给药

于实验第14日开始，给药组分别给予杜仲皮醇提物、杜仲雄花醇提物4 g原药材/（kg·d）和醋酸地塞米松0.125 mg/（kg·d）药液灌胃。给药体积均为0.2 mL/次，每日1次，连续21 d。

2.3 取材

于实验第36日，最后1次激发后24 h处理动物。摘眼球取血，部分外周血抗凝，其余部分静置2 h后离心取血清，置-80 ℃冰箱保存，直至测定。脱颈处死小鼠。心脏生理盐水灌洗后，取右肺组织立即置于液氮中冷冻，后转移至-80 ℃冰箱保存，直至测定。取左肺组织，浸泡于10%中性甲醛中固定48 h，用于组织病理切片、免疫组化检测。

2.4 肺组织病理观察

取肺组织，经脱水、透明、浸蜡与包埋，将蜡块常规切片、脱蜡，HE、PAS染色，中性树脂胶封片，于200倍光镜下观察。

2.5 血清卵清蛋白特异性IgE、白细胞介素-4、干扰素-γ、白细胞介素-13含量检测

取小鼠血清，ELISA测定血清OVA-IgE、IL-4、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-13含量，按照试剂盒说明书进行操作。

2.6 免疫组化检测肺组织细胞间黏附分子-1、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9和组织金属蛋白酶抑制剂1表达

DAB显色，以细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性判定标准。400倍光镜下每张切片随机选取5个视野拍照，用Image-Pro Plus图像分析软件进行吸光度（OD值）及阳性面积分析。比较各组ICAM-1、VEGF、MMP9、TIMP1阳性表达的差异。计算目标蛋白表达指数[阳性区域面积（%）×OD值]。

2.7 流式细胞术检测外周血白细胞介素-17+细胞的表达

取大鼠抗凝全血0.5 mL置于试管中，放入红细胞裂解液1 mL，静置10 min；1500 r/min离心2 min，弃上清液，PBS洗2遍，1500 r/min离心2 min，弃上清液，调细胞浓度为1×105；细胞固定液固定15 min，2500 r/min离心5 min，弃上清液混匀，再加破膜剂（1∶10）破膜20 min，2500 r/min离心5 min，混匀，再加IL-17AFTIC抗体，孵育30 min。流式细胞仪检测。

2.8 RT-PCR检测肺组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 mRNA表达

取肺组织100 mg放入去核酶试管内，加3 mL预冷Trizol液，超声匀浆60 s，按Trizol说明书进行操作，选取RNA，检测IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）RNA浓度。cDNA合成：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，总RNA（250 ng/μL）2 μL，加RNase Free dH2O至总体积为10 μL，混合后37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s反转录，进行PCR扩增。引物序列见表1。反应体系总体积为20 μL：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，Template（<100 ng）2 μL，dH2O（sterile distilled water）7.2 μL。扩增条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火及延伸60 ℃ 30 s，40 cycles。用相对定量2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS10.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 肺组织病理变化

正常组支气管及肺泡未见明显异常，PAS染色阴性；模型组细支气管高度痉挛，管腔狭窄，黏膜皱襞形成，支气管上皮杯细胞化生，黏液分泌物增多，支气管及血管周围大量嗜酸性粒细胞及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润，PAS染色可见支气管壁大量阳性细胞；杜仲皮组细支气管轻度痉挛，腔内少量黏液分泌物，支气管及血管周围嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润，PAS染色可见支气管壁阳性细胞；杜仲雄花组细支气管未见明显痉挛，腔内未见分泌物，仅见支气管及血管周围少量嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润，PAS染色可見支气管壁阳性细胞；地塞米松组细支气管未见明显痉挛，腔内无黏液分泌物，支气管及血管周围嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润，PAS染色可见支气管壁阳性细胞。见图1、图2。

4.2 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠血清卵清蛋白特异性IgE含量的影响

与正常组比较，模型组血清OVA-IgE水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组、杜仲雄花组OVA-IgE水平均明显降低（P<0.01）。见图3。

4.3 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠血清白细胞介素-4、干扰素-γ、白细胞介素-13水平的影响

与正常组比较，模型组血清IL-4、IL-13含量明显升高，IFN-γ水平明显降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组、杜仲雄花组IL-4、IL-13含量明显降低（P<0.05，P<0.01），杜仲皮组IFN-γ水平明显升高（P<0.01）。见图4。

4.4 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠肺组织细胞间黏附分子-1、血管内皮生长因子水平的影响

与正常组比较，模型组肺组织ICAM-1、VEGF表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组、杜仲雄花组ICAM-1、VEGF表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。见图5。

4.5 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠肺组织基质金属蛋白酶9和金属蛋白酶组织抑制剂1水平的影响

与正常组比较，模型组肺组织MMP9表达明显升高，TIMP1表达明显降低（P<0.01）；与模型组比较，杜仲雄花组MMP9表达明显降低（P<0.05），杜仲皮组、杜仲雄花组TIMP1表达明显升高（P<0.05，P<0.01）。见图6。

4.6 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠外周血淋巴细胞白细胞介素-17+细胞表达的影响

与正常组比较，模型组外周血淋巴细胞IL-17+细胞表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组、杜仲雄花组IL-17+细胞表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。见图7。

4.7 杜仲皮、杜仲雄花醇提物对模型小鼠肺组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组肺组织TNF-α、IL-6 mRNA表达明显升高（P<0.01）；与模型组比较，杜仲皮组、杜仲雄花组IL-6 mRNA表达明显降低（P<0.01），杜仲皮组TNF-α mRNA表达明显降低（P<0.05）。见图8。

5 讨论

杜仲主要成分有环烯醚萜类、杜仲胶、木脂素类及苯丙素类等化合物，其中木脂素类及环烯醚萜类所占比例较大，其次是黄酮类及其他类化合物。现代临床多用于治疗骨质疏松症、骨关节炎、风湿及类风湿性关节炎等[4]。迄今杜仲对气道变应性炎症的作用鲜有研究，但有报道杜仲雄花可抑制IgE介导的小鼠皮炎模型，可抑制血清IgE、IL-4，上调IFN-γ[5]。杜仲为补肝肾之品，在肺肾两虚型或肾阳虚型哮喘中亦有应用。前期研究发现，杜仲皮与杜仲雄花均表现出较明显的抗炎作用。为探讨杜仲对气道变应性炎症的作用，本研究应用OVA氢氧化铝凝胶腹腔注射，OVA生理盐水滴鼻激发，建立小鼠气道变应性炎症模型，给予杜仲皮、杜仲雄花醇提取物灌胃给药，观察肺组织病理改变，血清OVA-IgE水平，血清IL-4、IFN-γ、IL-13细胞因子水平，肺组织黏附分子ICAM-1、VEGF表达，肺组织基质金素蛋白酶MMP9、TIMP1表达。结果表明，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可改善气道变应性炎症，减轻支气管上皮杯细胞化生，减少黏液分泌，减少支气管及血管周围嗜酸性粒细胞及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润，减轻支气管痉挛。杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可抑制血清中OVA特异性IgE水平，表明对OVA致敏小鼠有抗过敏作用。气道变应性炎症存在着Th2类细胞因子过度表达，Th1/Th2失衡[6]。IL-13由Th2细胞产生，可诱导B细胞增殖和分化，促进IgE合成，活化嗜酸性粒细胞，延长嗜酸性粒细胞的存活，诱导气道高反应性等，在哮喘发生中起重要的致病作用。炎症渗出以及杯状细胞肥大、增生及黏膜下黏液腺增生可致黏液分泌亢进。过多的黏液可以形成黏液栓，阻塞气道。IL-4和IL-13可诱导黏液分泌[7]。杜仲皮、杜仲雄花醇提物可下调血清IL-4水平，杜仲皮醇提物可上调IFN-γ，杜仲皮、杜仲雄花醇提物可下调血清IL-13水平，对Th1/Th2细胞因子平衡有一定的调节作用。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成员之一，其与VEGF相互作用后可介导白细胞从血液循环中迁移到肺组织的炎症部位，这在支气管哮喘发病机制中起着重要作用[8-9]。二者与气道血管生成与气道重塑密切相关。杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可抑制肺组织ICAM-1、VEGF表达。

MMPs具有影响细胞迁移、降解结构蛋白的能力，被认为在气道重塑中起重要作用，MMP9是呼吸系统疾病中主要的MMP。TIMP1是MMP9的活性特异性抑制剂[10]。杜仲雄花醇提物可抑制肺组织MMP9表达，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可上调TIMP1表达，从而对MMP9活性有一定抑制作用。

Th17细胞分泌的IL-17A是强大的促炎细胞因子，其主要生物学功能是促进多种细胞释放炎性因子（如IL-6、TNF-α、IL-8等）而导致炎性反应。Th17细胞作为促炎细胞可诱导哮喘、自身免疫病的发生[11]。本实验模型组外周血淋巴细胞IL-17+细胞表达增加，肺组织IL-6、TNF-α mRNA表达上调，杜仲皮、杜仲雄花醇提物均可下调Th17细胞及IL-6 mRNA表达，杜仲皮醇提物能抑制TNF-α mRNA表达。

综上所述，杜仲皮、杜仲雄花醇提物可能通过抑制Th2类细胞因子，调节Th1/Th2细胞因子平衡，下调Th17细胞，抑制炎症因子聚集趋化及MMP活性，减少特异性IgE生成，减轻炎症反应作用，从而改善肺组织病理，抑制气道变应性炎症。杜仲皮和杜仲雄花可能成为潜在的气道变应性炎症的治疗药物。后期还将进一步研究杜仲皮、杜仲雄花对气道炎症的作用机制，为杜仲的进一步开发利用提供依据。

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（收稿日期：2017-07-12）

（修回日期：2017-08-04；編辑：华强）