长链非编码RNA基因NRON与肉鸡生长性状关联分析

杜志强，董翔宇，汪礼建，高卓然，李　辉

（1.农业部鸡遗传育种重点实验室，哈尔滨　150030；2.黑龙江省高校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨　150030；3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨　150030）

长链非编码RNA（lncRNA）是近年新发现的一类长度大于200个核苷酸，缺乏蛋白编码功能，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录生成的RNA[1]，可多层面调控转录后和表观生物学等过程[2-4]。起初，lncRNA被视为转录过程中的“转录噪音”。随后研究发现，lncRNA可作为生物信号分子、miRNA吸附“海绵体”、转录因子引导者、增强子及蛋白支架等，参与转录本可变剪接、基因组印记、染色体沉默、细胞周期调控、蛋白质合成等生物学过程[5-6]。

NRON是抑制NFAT（Nuclear factor of activated T cells，活化T细胞核因子）的lncRNA[7]，最初是在一个表达序列标签（EST）测序项目中，通过筛选512个保守非编码RNA序列而被找到[8-9]。NFAT是一类转录因子家族，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用[10]。除T细胞外，免疫细胞多可表达该类蛋白质[11]，如B淋巴细胞[12]、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等；NFAT也影响心肌、骨骼肌及神经系统发育[9]。此外，NFAT与脂肪细胞分化有关[13-14]。钙离子依赖的钙调蛋白磷酸酶调节NFAT活性[15-16]。随细胞内钙水平升高，钙调磷酸酶（Cn）被激活，直接脱磷酸以过磷酸化形式存在于NFAT蛋白，诱导其转移至细胞核内。转移至核内NFAT蛋白结合于靶基因启动子上，单独或与其他转录因子共同诱导基因表达。与钙调磷酸酶激活通路拮抗的NFAT激酶、糖原合成酶激酶（GSK）、酪蛋白激酶（CK），使NFAT蛋白磷酸化，从核内转出至细胞质[17]。NRON则通过与NFAT形成RNA-蛋白复合物形式调节NFAT脱磷酸作用[18]，参与艾滋病病毒HIV-1复制过程[19-20]。目前，鸡NRON功能研究国内外无相关报道。

本研究以东北农业大学肉鸡腹脂双向选择系和爱拔益加（Arbor acres，AA）肉鸡群体为材料，检测NRON单核苷多态性，进一步分析其同生长性状间关联，旨在探讨NRON基因影响肉鸡肌肉和脂肪组织生长发育分子机制。

1　材料与方法

1.1　材料

东北农业大学肉鸡高、低腹脂双向选择品系（NEAUHLF）经21个世代选育，高、低脂系间腹脂重和腹脂率差异显著。本研究以NEAUHLF第19世代鸡群和AA肉鸡随机群体为试验材料，选用高脂系公鸡114只，低脂系公鸡121只，AA群体公鸡母鸡共240只，收集各类生长性状：肉鸡1～7各周龄体重，7周龄屠宰时胴体性状。

组织表达检测样品采集过程如下：从高、低脂系第19世代（G19）肉鸡出生后1周龄开始取组织样品，每周采样一次，直至7周龄。取样分为两组：高脂系公鸡和低脂系公鸡。禁食10 h后称量体重并屠宰，屠宰后称量腹脂重，计算腹脂率（腹脂重/体重）。采集腹脂、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌胃、肠系膜周围脂、皮下脂、肌胃周围脂共10种组织。样品于0.75%氯化钠中清洗，液氮中速冻，-80℃保存待用。

1.2　方法

1.2.1引物设计与合成

1.2.1.1Real-Time RT-PCR引物设计

根据Ensembl数据库中鸡NRON基因序列（ENSGALG00000025631）和NFAT基因序列（ENSG ALG00000039300），结合内含子位置信息，选择Primer Premier 5.0设计Real-Time RT-PCR表达检测引物。内参基因TBP根据NCBI数据库信息，使用Primer Premier 5.0设计引物。引物信息见表1。

1.2.1.2酶切引物设计

根据Ensembl数据库鸡NRON基因序列（ENS⁃GALG00000025631），利用在线软件WatCut(http://watcut.uwaterloo.ca/)及Primer Premier 5.0设计酶切引物（见表2）。

表1　Real-Time RT-PCR表达检测引物Table 1　Primers for Real-Time RT-PCR

表2　酶切引物Table 2　Primers for restriction enzyme cleavage

1.2.2RNA提取及cDNA合成

高、低脂系肉鸡（各5只），分别提取组织总RNA（TRIZOL法），通过琼脂糖凝胶电泳分析，Nano⁃drop检测浓度，确保DNA和RNA质量和完整性。

取1 mL TRIZOL加入研磨（液氮中）组织样品50～100 mg，充分混匀。加入0.2 mL氯仿，离心后，水相转移到新离心管。加入400 mL异丙醇沉淀水相中RNA，离心后移去上清。加入1 mL DEPC处理的75%乙醇洗涤，RNA沉淀后移去上清，DEPC水溶解RNA。-80℃冰箱备用。利用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（购自TaKaRa宝生物公司）获得去除基因组cDNA。

1.2.3Real-Time RT-PCR

Real-Time RT-PCR反应体系为：SYBR®Pre⁃mix Ex TaqTM（2×）（购自宝生物工程（大连）有限公司）5μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，上、下游引物10μmol·L-1各0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 3.4μL，总体积10μL。反应条件：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，60℃复性延伸34 s，共40个循环。溶解曲线95℃15 s，60℃ 10 min，95℃15 s，每个样品设3孔重复。使用Real-Time RT-PCR仪型号为ABI 7500。

1.2.4PCR扩增

根据设计SNP1和SNP2基因作PCR扩增，PCR扩增体系为：50 ng·μL-1基因组 1 μL，10×PCR Buffer 0.8 μL，10 mol·μL-1上游引物0.2 μL，10 mol·μL-1下游引物 0.2 μL，10 mmol·μL-1dNTP 0.8 μL，Taq DNA 聚合酶0.1 μL，去离子灭菌水6.7 μL。

PCR扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，（55.7～60.7 ℃） 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72℃7 min。PCR产物于琼脂糖凝胶电泳检测，以5μL DNA Marker DL 2000为参照。电泳结束后利用凝胶成像系统观察扩增结果。

NRON基因变异位点可被限制性内切酶切割，选用限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphisms，RFLP）分型方法。

酶切体系设计为：内切酶10 U·μL-10.1 μL，10·Buffer 2.0 μL，PCR产物0.3～0.5 μg，去离子水加至20 μL。

将上述反应液混匀，于适当温度（依据不同酶而定）水浴中过夜消化，将全部反应液作琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物酶切效果及片段多态性。酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测并观察结果。

1.2.6基因效应分析

根据群体特点，构建基因型分析统计模型：

其中，Y为性状观测值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，L为品系固定效应，G×L为基因型和品系互作效应，F（L）为品系内家系随机效应，D（F,L）为家系与品系内母鸡随机效应，S为性别固定效应，G×S为基因型和性别互作效应，F为家系随机效应，D（F）为家系内母鸡随机效应，BW（第1或第7周龄体重）为协方差变量，e为随机效应。

模型①适于东北农业大学高、低脂系肉鸡双向选择系群体，模型②适于AA肉鸡随机群体；使用统计软件JMP 7.0检验基因型与性状间相关性，估计性状最小二乘均值。P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著。

2　结果与分析

2.1　鸡NRON基因多态性检测

2.1.1SNP位点发现

在婚姻中，不要试图改造或改变伴侣。人无完人，每个人身上都存在优点，也存在缺点。当初，你之所以选择和对方结婚，肯定是因为对方身上有你欣赏的地方，不妨学会欣赏对方的优点，忽略对方的缺点。一个善解人意的妻子或丈夫，应该尊重对方的个性，不要把自己的意志强加给对方，要给对方保留一定的自由空间，允许对方有自己的社交圈子。

本试验根据19世代高、低脂系肉鸡全基因组重测序数据（未发表结果），发现NRON基因上下游共10个单核苷酸多态性（SNP）位点。为进一步确定SNP真实性，根据Ensemble数据库中鸡NRON序列（ENSGALG00000025631），随机选取19世代高、低脂系肉鸡各3个基因组样本为模板，设计3段引物及PCR方法扩增长度分别为898、891和837 bp序列（覆盖2 757 bp，包括NRON基因和其上下游各1 200 bp序列）。PCR产物测序后与鸡基因组（Gallus 5.0）比对分析，验证10个SNP，后续关联分析使用其中两个SNP位点，1个位于NRON基因，另1个位于NRON基因下游。具体SNP位置信息如图1所示。

图1　NRON基因SNP相对位置信息Fig.1　Relative positions of SNPs discovered in NRON

2.1.2多态性检测及分析

采用SNP-RFLP技术检测NRON基因两个SNP位点，高、低脂肉鸡和AA肉鸡群体中分别检测3种基因型。检测NRON基因多态性PCR扩增片段产物长度分别为 217 bp（SNP1）和 202 bp（SNP2）。SNP1片段经SspⅠ限制性内切酶酶切后产生长度为143 bp和74 bp片段，根据条带不同分别检测3种基因型，分别命名为GA基因型（217 bp+143 bp+74 bp）、AA基因型（143 bp+74 bp）和GG基因型（217 bp）；SNP2片段经EaeⅠ限制性内切酶酶切后产生长度为166 bp和36 bp片段，根据条带不同分别检测到3种基因型，分别命名为GG基因型（202 bp）、CC基因型（166 bp+36 bp）和GC基因型（202 bp+166 bp+36 bp）（见图2）。

关联分析结果见表3～4，AA肉鸡群体中，SNP1位点与生长性状无关联，SNP2位点与心脏重、3周龄和5周龄显著相关。高、低脂系肉鸡群体中，SNP1位点与肌胃重、骨盆宽、胸角性状显著相关，SNP2位点与心脏重、腺胃重、胸宽性状显著相关。同时，AA肉鸡群体中，虽然SNP2位点多态性与腹脂重不相关，但显性效应值大于加性效应值，且显性度为1.3，表明SNP2位点有超显性且影响腹脂重；高、低脂系肉鸡群体中，SNP2位点与胸宽性状显著相关，且显性效应值大于加性效应值，显性度为12.9，表明SNP2位点有超显性且影响胸宽；但在两个群体中，心脏重显性度均不明显。

2.2　连锁不平衡分析

以东北农业大学肉鸡高、低脂双向选择品系第19世代资源群体（G19）235只公鸡和AA群体240只公鸡和母鸡为试验材料，Haploview软件分析SNP1和SNP2在两个群体间连锁不平衡关系。结果表明，AA肉鸡群体中，SNP1和SNP2位点间连锁不平衡程度较强（D'=1.0）（见图3a）；而高、低脂系肉鸡群体中，SNP1与SNP2几乎不连锁（D'=0.03，见图3b）。

图2　NRON基因SNP多态片段产物凝胶电泳结果Fig.2　Gel electrophoresis of NRON SNP RFLP

表3　AA肉鸡群体NRON基因SNP多态性与生长性状关联分析Table 3　Association of NRON polymorphisms with growth traits in AA broilers

表4　高、低脂系肉鸡群体中NRON基因SNP多态性与生长性状关联分析Table 4　Association of NRON polymorphisms with growth traits in HLF broilers

图3　AA和高、低脂系肉鸡群体中NRON SNP连锁不平衡分析Fig.3　Linkage disequilibrium analysis of NRON SNPs in AA and HLF broilers

2.3　在不同组织中鸡NRON基因表达规律

Real-Time RT-PCR检测NRON基因高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织表达情况（n=5）。

由图4可知，1、4、7周龄，NRON基因在肉鸡高脂系表达水平显著高于低脂系（P＜0.05）；且NRON及NFAT基因随周龄增加，表达量呈递增趋势。

同时，检测NRON基因在高、低脂肉鸡心脏、腺胃、肌胃、胸肌、肝脏、睾丸、脾脏组织中表达情况（n＝3）。

由图5可知，NRON基因在睾丸和脾脏组织中不表达；肌胃、肝脏中表达差异不显著；心脏、腺胃、胸肌中表达差异极显著（P＜0.01），且在心脏和腺胃中，高脂系显著高于低脂系，胸肌中，高脂系显著低于低脂系。

图4　 鸡脂肪组织中NRON及NFAT的mRNA表达水平Fig.4　mRNA expression patterns of NRON and NFAT in abdominal adipose tissues

图5　 鸡不同组织中NRON的mRNA表达水平Fig.5　mRNA expression patterns of NRON in different tissues

3　讨论与结论

3.1NRON和NFAT与心脏发育

本研究发现NRON与肉鸡心脏重极显著相关，高、低脂系肉鸡中，NRON基因在心脏中表达差异极显著，高脂系表达显著高于低脂系。研究表明NFAT基因为调控心房肌生长发育重要因子，其功能紊乱导致心脏疾病，在人类心脏表达基因中，13%在启动子区有NFAT结合位点，这些基因中20%～40%在心脏病发病前期发生表达修饰[21]。NFAT激活由钙调磷酸酶介导，对于肥厚心肌组织中心肌细胞基因表达有重要作用[22]，Putt等研究表明NFAT是心肌肥大反应调节元件[23]。在心肌肥大心脏中，NFAT脱磷酸化增强自身核定位和转录活性[24-25]，导致NFAT活性在患心脏病或年老患者中均明显增强[26]。同时，抑制NFAT基因活性可干扰心肌肌钙蛋白基因转录过程，导致心房肌变薄[10]。NRON基因作为NFAT抑制物[9]，作为一种新生物标记可预测心脏病[27]。NRON可作研究肉鸡心脏生长发育过程标记基因。

3.2　NRON与肌肉生长发育

除与心脏生长发育密切相关外，NRON与肉鸡其他生长性状（3周龄重、5周龄重、腺胃重、胸宽）也显著相关（P＜0.05）。高脂系胸肌中NRON表达水平显著低于低脂系。NRON基因表达研究表明，在人胎盘组织、胸腺、脾脏中NRON高丰度表达，在睾丸、肾脏、大脑和肾上腺组织中也检测到NRON基因较高丰度表达[9]。小鼠骨骼肌、胸腺中NRON基因高丰度表达，脾脏、淋巴组织和肺组织也可检测明显表达[9]。NRON基因Northern杂交结果同其基因表达结果吻合，且NRON转录本在不同组织中有特异性剪接形式，可能有其他未知生物学功能[9]。研究结果暗示NRON与骨骼肌和平滑肌生长发育可能相关。因此，NRON基因与肉鸡体重等生长性状显著相关，胸肌中差异表达，因此可能被作为重要生产性状候选基因，应用于分子育种和肉鸡生产。

3.3　NRON与脂肪组织生长发育

NRON及NFAT基因在东北农业大学高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中表达差异显著（P＜0.05），表达趋势一致，均为肉鸡高脂系中mRNA表达水平高于低脂系。NFAT转录因子家族源自REL（c-Rel）-nuclear factor-κB（REL-NF-κB）转录因子家族[28]，被认定为活化T细胞中重要组成因子，其受钙调磷酸酶调节特性决定NFAT在多种生物过程均有调节功能[29-31]，如非免疫细胞生成[32-33]，心肌形成[34-36]和神经回路[36]等。最初并未发现NFAT与脂肪生成相关[14,30]，近期Graef等研究发现其在脂肪细胞分化过程中具有重要作用[37-39]。NFAT可与转录因子CCAAT/增强子结合蛋白互作形成复合元件[38-39]，调节脂肪生成重要调节因子过氧化物酶增殖体受体γ2（PPARγ2）基因表达[40-41]，参与脂肪生成；此外，NFAT与脂肪酸结合蛋白（aP2）同样有关[42-43]，在小鼠3T3-L1前脂肪细胞中，NFAT蛋白结合aP2启动子并反式调控aP2转录过程，影响脂肪细胞分化[44]。

作为脂肪生成重要调控因子，去乙酰化酶SIRT1不仅结合NF-κB使其去乙酰化，抑制NF-κB转录激活活性[45]，还抑制NFAT活性[46]，抑制脂肪生成。NFAT与脂肪分化标志基因脂联素密切相关。NFAT家族成员NFAT3/c4通过结合脂联素启动子区，激活脂联素启动子活性，调控其在小鼠3T3-L1脂肪细胞中表达[47]。综上，NFAT可通过多种分子机制促进脂肪细胞分化，NRON则通过抑制NFAT脱磷酸化而促进脂肪分化过程。

3.4　NRON功能性SNP鉴定

通过连锁不平衡分析发现NRON基因中SNP1和SNP2位点在高、低脂系肉鸡群体中连锁不平衡程度较强，且两个位点与生产性状关联分析结果不同。通过转录因子结合位点在线预测，发现NFAT蛋白结合NRON序列十分接近SNP1（未发表结果）。表明SNP1位点可能影响NRON与NFAT形成RNA-蛋白复合物，参与NRON调控NFAT功能分子生物学过程。本研究仅检测NRON基因单核苷酸多态性位点与生产性状间相关及组织中表达情况，需进一步开展SNP功能性鉴定和相关作用机制分析，揭示NRON与肌肉和脂肪性状间分子调控机制。