低频电针对心肌缺血损伤大鼠心包经经穴血流灌注量的影响及治疗次数的干预效应*

孙晓敏，嵇　波，赵国桢，王　丹，严明娜，白红新，戴　健，路雅雯，刘翼天，葛云鹏，苏　杭，吴娇娟，游　敏，程　凯

(北京中医药大学,北京 100029)

人体体表之间、穴位与脏腑之间、脏腑与体表穴位之间存在着特定的联系，这种“内属腑脏、外络肢节”的经穴-脏腑相关学说是古人创立的经络学说的核心内容，也是针灸学领域的研究热点。关于经穴-脏腑相关的研究多集中于经穴感受刺激对疾病的调节方面，包括对比经穴刺激前后脏腑相关参数的变化情况[1-2]，刺激不同穴位后比较调节脏腑的相关物质等[3-5]。然而《灵枢·九针十二原》记载：“五脏有疾也，应出十二原”。强调各经穴对脏腑病理变化有相应的反映。近年来也有关于经穴反映内脏生理和病理变化的研究，如基于脏腑症状的不同观察相关经穴的状态[6]，也有人观察脏腑出现病理性变化后经络线上经穴部位感觉、形态和色泽情况[7]、经皮氧分压和微循环血流灌注变化[8]等，发现脏腑病变后相关经穴会有特异性改变。但是关于脏腑处于不同状态下相关经脉不同穴位皮肤血流灌注量的变化研究较少，尤其是这种变化与低频电针刺激经穴和非经穴及与治疗次数关系如何，尚需要明确。本研究使用激光散斑衬比成像技术，检测大鼠处于正常生理状态、假手术状态、心肌缺血损伤状态、低频电针“内关”穴干预状态和低频电针非穴干预状态时，心包经上“内关”“郄门”和“天泉”穴区皮肤血流灌注量，并对比观察治疗1次和治疗3次效应的差别，探寻低频电针经穴和非穴通过对心肌损伤的调节后对心包经不同穴位反映的影响及治疗次数的干预效应，丰富脏腑-经穴相关理论，为临床治疗提供依据。

1　材料

1.1　实验动物及分组

7周龄清洁级Wistar大鼠60只，雄性，体质量控制在200～230 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，饲养于北京中医药大学针灸推拿学院国家重点实验室动物房，室内温度维持在(24±1)℃，相对湿度保持(45±5)%，使用日光灯照射，12 h明暗交替，饲以普通清洁级大鼠饲料、自由饮水。适应性饲养72 h后按照随机数字表法分为治疗1次组和治疗3次组，每大组再分为5小组，包括空白对照组、假手术组、心肌缺血损伤组(简称模型组)、低频经穴组和低频非穴组。

1.2　主要试剂和仪器

20%乌拉坦(天津药业焦作有限公司生产，批号06051121)；注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂生产，批号CD1408008-1)。

一次性无菌注射器(山东新华安得医疗用品有限公司)；无菌纱布片(北京圣维尔医疗用品有限公司)；显微持针钳(三河市三友医疗器械厂，批号131001)；恒温恒湿实验系统(SG-H1，南京盛光光电医疗仪器有限责任公司)；医用冷光源(LG100-2，上海安信光学仪器制造有限公司)；BL-420E+生物机能实验系统(TM003-0024，成都泰盟科技有限责任公司)；动物呼吸机(HX-300S，成都泰盟软件有限公司)；激光散斑血流成像仪(瑞典，Perimed公司)；华佗牌无菌针灸针(0.20 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；电针仪：二导HAN’s穴位刺激仪(LH202H，北京华卫产业开发有限公司)。

2　方法

2.1　模型制备

采用大鼠冠状动脉左前降支结扎术制备心肌缺血损伤模型[9]，连接BL-420E+生物机能系统以检测肢体Ⅱ导联心电变化情况；假手术组：对大鼠冠状动脉左前降支只穿线，不结扎。结扎后结扎部位心肌颜色发绀，心电图J点抬高，初步证实造模成功。排除术后死亡及造模不成功的大鼠。

2.2　取穴

根据大鼠形态和定位解剖特点，并参照《实验针灸学》[10]穴位标准， “内关”位于前肢内侧，距腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间；“郄门”位于前肢内侧，距腕关节约7 mm左右尺桡骨缝间；“天泉”位于腋前横纹头下约5 mm左右；非穴为“环跳”穴外5 mm(后肢髋关节后上缘外5 mm)。在检测各穴血流灌注量前，用水性笔标定大鼠的各个穴位，检测时用牙签指示各检测穴位，以确保穴位定位的准确性。

2.3　处理方法

空白对照组、假手术组和模型组：常规饲养，只在电针处理时抓取并固定1次，以保证处理条件相同，1天或连续3天；低频经穴组：造模成功后，毫针直刺左侧“内关”穴约0.2 cm，在左侧“内关”穴外上方0.5 cm非穴处，皮下平刺1 mm，连接HANS/LH202型电针仪，频率为2 Hz，电流强度以大鼠前肢微微颤动为度(1 mA)，造模后每日电针处理1次，治疗1天或连续治疗3天；低频非穴组：除电针穴位为非穴外，其余各项同低频经穴组。

2.4　指标检测

经穴区域皮肤血流灌注量检测：治疗1次组于电针治疗1次后、治疗3次组于电针治疗3次后进行检测。检测前24 h将大鼠双侧“内关”“郄门”和“天泉”穴区脱毛。调节工作环境，维持温度(24±1)℃，相对湿度(55±5)%，并且无日光直射及明显空气对流。大鼠麻醉后取仰卧位固定于台架上，充分暴露待测部位，PSI预热后将大鼠置于激光镜头下，检测时控制PSI扫描头对准待测部位，尽量保持大鼠的相对安静。记录各组检测区域血流图，用PIMSoft血流仪成像处理软件进行分析。打开各组各检测区域血流图像，定义“内关”“郄门”和“天泉”为感兴趣区域(ROI)，选择测量穴区面积1.5～2.5 mm2内平均血流灌注量(PU)，依据盲法分别读取的每个穴位血流值，求出每只大鼠“内关”“郄门”和“天泉”区域血流灌注量数值。经穴穴区血流灌注量记录值计算方法：左、右侧经穴穴区血流灌注量的平均值为经穴穴区血流灌注量记录值，用于数据统计分析。见封三彩图1。

心电图检测：血流灌注量检测完成后，连接BL420E+生理记录仪，针形电极分别插入大鼠左前肢(黄色电极)、右后肢(红色电极)和左后肢(黑色电极)，开始记录各组大鼠心电图的肢体II导联。待心电图的肢体II导联处于平稳状态时，取3个连续心动周期，分别记录心电图中相邻J点与QRS波起始点的差值作为初始“J点”差值，3个初始“J点”差值的平均值=“J点”差值，用于数据统计分析。

2.5　统计学分析

3　结果

3.1　各组大鼠心电图中“J点”差值

分别纵向比较治疗1次组或治疗3次组。与空白对照组相比较，治疗1次组和治疗3次组的假手术组“J点”差值均无显著差别(P>0.05)，而模型组“J点”差值均显著升高(P<0.01)；与模型组相比较，治疗1次组和治疗3次组的低频经穴组“J点”差值均显著降低(P<0.01)，但是低频经穴组J点差值仍高于空白对照组“J点”差值；低频非穴组“J点”差值无明显变化(P>0.05)。结果见表1。

横向对比治疗1次组和治疗3次组同一心肌状态时“J”点差值，与治疗1次后相比较，空白对照组、假手术组、模型组、低频非穴组“J”点差值在治疗3次后有升高趋势。

表1　大鼠心电图“J点”差值的变化

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01

3.2　各组大鼠心包经经穴皮肤血流灌注量的变化

电针治疗1次后，分别纵向比较心包经上“内关”“郄门”和“天泉”穴区血流灌注量：与空白对照组相比较，假手术组3个穴区血流灌注量无统计学差异(P>0.05)，而模型组3个穴区血流灌注量均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，低频经穴组“内关”和“郄门”穴区皮肤血流灌注量分别显著升高(P<0.01或P<0.05)，而低频非穴组差异无统计学意义(P>0.05)，低频经穴组或低频非穴组“天泉”穴区无显著变化(P>0.05)。结果见表2。

表2　治疗1次后心包经经穴皮肤血流灌注量的变化

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01，▲▲P<0.05

电针治疗3次后，分别纵向比较心包经上“内关”“郄门”和“天泉”穴区皮肤血流灌注量：与空白对照组相比较，假手术组3个穴区无显著差异(P>0.05)，而模型组3个穴区皮肤血流灌注量均显著降低(P<0.01)；与模型组相比较，低频经穴组3个穴区皮肤血流灌注量显著升高(P<0.01或P<0.05)，而低频非穴组差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表3。

表3　治疗3次心包经经穴皮肤血流灌注量的平均值变化

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01，▲▲P<0.05

分别横向比较“内关”“郄门”和“天泉”穴区3次治疗后与1次治疗后皮肤血流灌注量情况，发现低频经穴组“内关”穴区和“天泉”穴区皮肤血流灌注量均有升高趋势，尤其是低频经穴组“天泉”穴区皮肤血流灌注量升高显著(P<0.01)。结果见表2、表3。

4　讨论

脏腑处于生理状态或病理状态时，体表相关经脉不同穴位的反映有一定的差异。如有研究发现人体处于生理状态时，穴位电阻从井穴到合穴呈递减趋势[11]；当人体处于病理状态时，许多广泛前壁心梗、下壁后壁心梗患者大陵至内关段多表现为单个小米粒大小的结节[7]；电针穴位治疗前后，相关经脉不同穴位的经皮氧分压[8]、皮肤温度[12]的变化存在差异。说明机体状态不同，其脏腑相关经脉不同穴位的反应存在差异。

激光散斑衬比成像(LSCI)无需跟踪剂，不接触组织，就能一次性采样大范围组织和器官的表面血流，把对血流灌注量的影响降至最低，逐渐成为针灸研究血流灌注量的新兴技术。有研究使用LSI技术观测电针对正常小鼠肝脏血流灌注量的影响[13]、电针对不同时间段酒精性肝损伤小鼠肝脏血流的干预作用[14]，直观精确地反映了电针过程中肝脏表面血流灌注量的变化趋势；也有研究使用LSI技术观察不同针刺方法刺激健康人合谷穴对外周皮肤血流灌注量的影响[15]。然而，关于脏腑处于不同状态对相关经脉不同穴位血流灌注量的对比研究较少。因此，本研究借助心肌缺血损伤大鼠模型，比较心肌处于生理状态、缺血损伤病理状态、低频电针刺激经穴或非穴时，心包经上“内关”“郄门”和“天泉”穴区血流灌注量的变化情况，并横向比较治疗1次和治疗3次后效应的差别，探寻低频电针经穴和非穴通过对心肌损伤的调节后对心包经不同穴位反映的影响及治疗次数的干预效应。

《灵枢·经络》载：“手心主之别，名曰内关。去腕2寸，出于两筋之间，别走少阳，循经以上系于心包，络心系，心系实则心痛，虚则烦心。”说明内关穴为手厥阴心包经络穴，主治心痛、心悸、胸闷等心脏疾病。研究发现[16]针刺内关穴可有效减少无症状心肌缺血患者的ST段压低持续时间和压低次数，能降低心率和体循环动脉血压；还有研究发现[17]，针刺“内关”可缓解心肌缺血大鼠小动脉痉挛，改善心肌缺血。本课题前期研究[12,18-19]也证实，电针“内关”穴对急性心肌缺血大鼠的心电图“J”点差值，心肌肌钙蛋白、肌酸激酶以及心肌组织形态等有明显的改善作用，一定程度上进一步明确了针刺“内关”穴改善大鼠急性心肌缺血的确切效应。在本研究中，结扎大鼠冠状动脉左前降支后第1天和第3天，心电图“J”点差值较空白对照组均显著升高，提示大鼠处于心肌缺血损伤状态；低频电针“内关”穴后，大鼠心电图“J”点差值显著下降，说明低频电针“内关”穴对心肌缺血损伤有一定的修复作用，横向比较治疗3天和治疗1天各组大鼠心电图“J”点差值，治疗3天时正常组、假手术组、模型组和低频非穴组均高于治疗1天，正常组和假手术组可能与大鼠麻醉后身体虚弱，进食饮水较正常减少有关；模型组和低频非穴组与心肌持续缺血有关。

本研究显示大鼠处于生理状态时， “内关”“郄门”和“天泉”穴血流灌注量呈递增趋势，这与穴位循经性理论相一致。皮肤血流灌注量变化由交感神经调控，且以交感缩血管神经支配为主[20]。在心肌缺血时，皮肤等交感神经分布密集的器官内血管会明显收缩，以保证重要组织器官的血流供应，此时皮肤血流灌注量减少[12]，因此，大鼠处于心肌缺血状态时，“内关”“郄门”和“天泉”穴皮肤血流灌注量显著下降。

内关是心包经络穴，临床实践表明以内关为主治疗无症状心肌缺血有显著疗效[16]；郄门是手厥阴心包经郄穴，与心脏存在特异性联系；有电刺激猫左心下神经发现左“天泉”穴区与左心下神经有相对特异性联系[21]；3个穴位分别位于心包经上、中、下3个位置，所处位置具有层次性，所以选择以上3个穴位观测不同心肌状态下心包经经穴血流灌注量的变化。低频电针“内关”穴治疗1次时，“内关”“郄门”穴血流灌注量较心肌缺血状态时显著升高，但“内关”穴较“郄门”穴更接近空白对照组，这可能与郄门是心包经郄穴，气血变化最先反应在经脉深层有关。

针刺治病的时效关系是针灸临床中普遍存在的问题，有研究通过对中风偏瘫病人皮肤痛阈的针刺前后变化比较，证明日针2次的疗效明显优于日针1次，疗程一定时增加刺激量可提高疗效[22]，在此基础上又有研究证明日针3次的疗效明显优于日2次[23]。本研究低频电针“内关”穴治疗3次时，“内关”“郄门”和“天泉”穴血流灌注量较心肌缺血状态时显著升高，而治疗1次时“天泉”穴血流灌注量较心肌缺血状态时无明显变化，提示治疗次数的增加影响针刺疗效，治疗3次对心肌缺血的改善程度优于治疗1次，但治疗3次是否是最优针刺方法，还需进一步研究。

有研究表明电针心包经的大陵、郄门、曲泽穴均有改善心动过缓大鼠心率与心功能，而非穴未呈现此功能[24]。本研究对比观察低频电针“内关”穴和非穴对心肌缺血大鼠心包经上“内关”“郄门”和“天泉”穴血流灌注量的变化，发现低频电针“内关”穴时，3个穴区浅血流灌注量较心肌缺血状态时显著升高，低频电针非穴时，3个穴区血流灌注量较心肌缺血状态时无明显变化，提示低频电针经穴可能通过抑制交感神经的兴奋性，舒张血管，从而提高相关经脉同经异穴血流灌注量，而低频电针非穴无此作用，进一步证实了经穴的针刺效应优于非经穴，与以往研究相符。

综上所述，大鼠心包经上“内关”穴皮肤血流灌注量更能特异性反映大鼠心肌状态，与心肌缺血损伤后低频电针刺激的穴位和治疗次数有一定的相关性。