基于氧传感技术测定烟草种子活力的初步研究

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(玉溪中烟种子有限责任公司，　云南 玉溪 653100)

种子活力是衡量种子质量的重要指标[1-4]，高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，对农业生产具有十分重要的意义。目前，ISTA(国际种子检验协会)推荐的种子活力检测方法[5-8]主要有：幼苗分级法、幼苗生长速率测定、加速老化法、抗冷测定法、砖砾法、四唑法等。这些方法有的耗时、费钱、费力，有的要求操作者具有丰富经验，在实际应用中均受到一定限制。对于烟草种子，其活力主要是通过标准发芽试验的发芽率来判定[9-10]，但发芽试验耗时较长，结果与田间实际出苗相关性低[11-12]，随着烟区对烟草种子质量要求的逐步提高[13-14]，该法越来越不能满足快速、精确检测烟草种子质量的需求。随着信息技术与生物技术的发展，人们期待一种精确、快速、自动化的种子活力测定方法。

Q 2氧传感技术是荷兰ASTEC公司发展的一种高效、自动、精确检测种子活力的新方法[15-17]，其检测原理是通过监测种子萌发过程中的呼吸耗氧情况来判定种子的活力。细胞的呼吸作用是各生物组织新陈代谢的基本能量来源，低活力种子细胞组织的呼吸活力弱，且在吸胀时呼吸体系的自我修复能力差，萌发需要更长时间的呼吸作用；高活力的种子呼吸活力强，萌发需要较短时间呼吸作用。目前，Q 2氧传感技术已应用于甜菜、番茄、玉米、水稻、林木种子的活力检测[18-20]，且效果较好，而其在烟草种子活力检测方面的应用还未见报道，因此，研究将利用Q 2氧传感技术检测不同生产年份、不同密度、不同催芽工艺烟草种子的氧传感指标，并分析该技术在烟草种子活力测定方面的应用效果。

1　材料与方法

1.1　材　料

所有试验种子均来自玉溪中烟种子有限责任公司。

不同生产年份烟草种子为玉溪中烟种子公司18 ℃下保存的库存裸种，具体品种和生产年份如下：云烟85(1997年)、云烟85(2009年)、云烟87(2001年)、MS云烟87(2014年)、K 326(1996年)、MSK 326(2013年)、TN 90(2001年)、TN 90(2009年)。

不同密度烟草种子为2014—2015年度玉溪中烟种子有限责任公司西双版纳冬繁基地良繁生产的云烟105裸种经不同密度液体介质分选后所得。分选过程如下：采收云烟105成熟蒴果，经干燥脱粒、风选、筛选后去除种皮、杂质，将干净种子倒入2～3倍体积的密度为0.8 g/mL的正己烷和氯仿的混合溶液，种子分为上下2层，分离后得到上、中层密度≤0.8 g/mL的种子和下层密度>0.8 g/mL种子，舍弃上、中层种子，下层种子则倒入2～3倍体积的密度为0.9 g/mL正己烷和氯仿的混合溶液，分离后得到上层0.8 g/mL<密度≤0.9 g/mL的种子和下层密度>0.9 g/mL的种子，重复以上步骤，利用不同密度的正己烷和氯仿组成的液体有机介质的浮力，将种子分成0.8～0.9 g/mL、0.9～1.0 g/mL、1.0～1.1 g/mL、1.1～1.2 g/mL等不同的密度区间，然后检测各个密度区间种子的呼吸代谢、发芽、出苗情况。

不同催芽工艺处理的烟草种子为玉溪中烟种子有限责任公司库存良种。催芽工艺如下：选择同一批号MS云烟85、MSK 326、云烟97种子，分别放入清水、50 mg/L的GA3溶液当中，浸种3 h，加入6 g/L的CuSO4溶液消毒0.5 h，排出消毒液，清水清洗种子，再次加入50 mg/L的GA3溶液催芽引发20 h，取出种子，铺为薄层，自然风干至含水量低于10%，干燥后种子进行呼吸代谢、发芽、出苗检测。

1.2　方　法

1.2.1种子呼吸代谢分析

在96孔板的各个小孔(515μL)中加入500μL浓度为0.5%的琼脂溶液，待琼脂凝固后，每个小孔内放入1粒待测裸种，覆盖带有荧光材料的塑料薄膜于板上，加热至塑料薄膜紧紧密封每个小孔。将密封后96孔板置于Q 2氧传活力分析仪上，保持室内温度为25 ℃，设置检测时间为180 h，检测间隔时间为0.5 h，启动仪器，开始检测种子萌发过程呼吸耗氧情况。

根据每次测量记录的氧气浓度和时间绘制的耗氧曲线，由系统自带的ANS软件分析耗氧曲线，得到烟草种子萌发过程呼吸代谢指标：增加代谢时间(IMT)、氧代谢率(OMR)、临界氧气压力(COP)、相对发芽时间(RGT)、同质性(HOM)。

IMT(Increased Metabolism Time)表示氧气消耗速率从初始的缓慢速度开始增加的时间，单位为小时，反映了种子吸胀萌动至胚根突破种皮的快慢。高活力的种子在短时间内吸胀萌动，胚根突破种皮，IMT值低。

OMR(Oxygen Metabolism Rate)是种子胚根突破种皮后到受低氧胁迫氧气消耗速率变慢之间的呼吸速率，单位是百分比氧气浓度每小时，反映了种子萌发过程的代谢活动强弱。高活力的种子经过吸胀萌动后，细胞器发育良好，细胞膜自我修复充分，生物酶活力强，代谢旺盛，表现为OMR值高。

COP(Critical Oxygen Pressure)是呼吸速率开始减速时氧气百分比浓度，单位为百分比氧气浓度。由于种子萌发过程处于密闭试管中，当试管中氧气浓度降低到一定水平时，种子萌发处于低氧胁迫状态，种子呼吸速率降低。因此，COP值反映了种子耐低氧胁迫的能力。

RGT(Relative Germination Time)为非低氧胁迫条件下的理论萌发时间，是斜线延长至x轴的交点，单位为小时。由于这是假设在非低氧胁迫条件下氧气消耗到零时的推断时间，因此RGT值跟每个种子的实际萌发时间直接相关。

HOM(Homogeneity)表示理论萌发时间分布差异的大小，用来指示种子萌发或出苗均匀一致的程度。

1.2.2发芽指标检测

在培养皿中垫2层湿润滤纸，每个培养皿中均匀放置100粒种子，加盖，每个样品3次重复，种子置于光照培养箱内，25 ℃下每天光照12 h，发芽期间保持滤纸湿润。每天统计种子发芽情况至第7天，取3次重复的平均值。

发芽势：萌发第5天的发芽率；

发芽率：萌发第7天的发芽率；

发芽指数=∑Gt/Dt(式中：Gt为第t天的发芽种子数；Dt为发芽天数)。

1.2.3出苗率检测

使用20×10孔的育苗盘进行漂浮育苗，每个批号种子2次重复，15 d统计种子出苗率，取2次平均值。

1.2.4相关性分析

采用SPSS 17.0软件分析IMT、OMR、COP、RGT、HOM与种子出苗率之间的相关显著性和相关系数。

2　结果与分析

2.1　不同生产年份烟草种子的氧传感指标、发芽指标与出苗率的关系

由图1可以看出，25 ℃下不同品种、不同生产年份烟草种子在吸水萌发的前60 h耗氧曲线斜率较小，说明种子呼吸作用较弱，氧气消耗速率较低，种子应处于吸胀至胚根突破种皮阶段；60～100 h，种子呼吸作用增强，呼吸速率大幅提高，氧气含量急剧降低，该阶段烟草种子胚根突破种子，快速伸长，子叶开始突破种皮甚至展开，需要快速呼吸作用为萌发提供大量能量；萌发100 h后，种子处于低氧环境，虽然萌发仍需要较高能量供应，但受低氧胁迫影响，呼吸作用逐渐降低，直至氧气消耗完毕。

由表1可以看出，对于云烟85、云烟87(MS云烟87)、K 326(MSK 326)、TN 90不同生产年份种子，同一品种年份越长，发芽势、发芽率、发芽指数越低。从相关性来看，发芽势、发芽率、发芽指数、OMR均与出苗率呈正相关，而IMT、COP、RGT、HOM与出苗率呈负相关。其中，OMR值即种子氧代速率与出苗率相关性最高，在0.01水平呈显著正相关，相关系数达到0.847，而IMT值即萌发启动时间与出苗率在0.05水平呈显著负相关，相关系数为-0.728，这2个指标比使用传统发芽指标如发芽势、发芽指数来反映种子实际出苗情况相关性更好，更能反映种子活力。

表1不同生产年份烟草种子呼吸代谢指标与发芽指标

品种生产年份含水量(%)发芽势(%)发芽率(%)发芽指数IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)云烟8519973.2577.784.720.4955.041.7430.9135.2126.792.5云烟8520093.3493.794.723.3952.21.9228.9111.216.5594.0云烟8720013.4682.391.021.6359.061.6231.2166.3184.581.5MS云烟8720143.0494.798.023.7449.081.7329.1243.5104495K32619963.2660.381.316.8359.231.6230.4134.431.0383.5MSK32620133.5197.098.324.3952.661.8828.4114.519.6798.5TN9020013.5573.389.021.6152.51.6525.711295.584.5TN9020093.5282.091.320.4655.11.6826.7150.2317.589.5相关系数r0.6920.6120.674-0.728∗0.847∗∗-0.1-0.075-0.207

注：“*”在0.05水平显著相关，“**”在0.01水平呈显著相关。下同。

表2不同密度烟草种子呼吸代谢指标与发芽指标

品种密度区间含水量(%)5d发芽势(%)7d发芽率(%)发芽指数IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)云烟1050.8<ρ ≤ 0.93.511.348.78.950.51.8739.41995728247.80.9<ρ ≤ 1.03.745.384.015.846.31.9237.1312116748.51.0<ρ ≤ 1.13.180.790.719.743.92.0537.0236.6841521.1<ρ ≤ 1.23.798.398.623.840.712.3631.45101.524.6764相关系数r0.8270.6820.837-0.8670.994∗∗-0.969∗-0.551-0.59

图1　不同生产年份烟草种子呼吸代谢平均曲线

2.2　不同密度烟草种子呼吸代谢指标、发芽指标与出苗率的关系

利用Q 2氧传感技术分析了云烟105不同密度烟草种子呼吸代谢情况，发现密度越高，种子OMR值越高，呼吸速率越快，萌发启动时间越短，发芽质量越好，尤其是密度区间在1.0～1.1 g/mL、1.1～1.2 g/mL种子OMR最高，这与种子发芽结果以及漂浮育苗出苗结果一致，即随着种子密度的提高，发芽势、发芽率、发芽指数、出苗率等都逐渐提高，种子活力增加。而通过相关性分析可知，OMR与种子出苗率在0.01水平呈极显著正相关，相关系数达到0.994，COP与出苗率在0.05水平呈显著负相关，相关系数为-0.969，而发芽势、发芽率、发芽指数与出苗率的相关系数分别为0.827、0.682、0.837，均未达到显著相关。

2.3　不同催芽工艺烟草呼吸代谢指标、发芽指标与出苗率的关系

从发芽指标来看，3个品种种子经GA3浸种和清水浸种处理发芽势、发芽率、发芽指数均差异极小，与出苗率的相关性也极低，种子活力基本无法区分。从呼吸代谢指标来看，MS云烟85、云烟97的种子经GA3浸种比经清水浸种处理的OMR值有所提高，但提升幅度不大，说明种子呼吸速率略有提高，而HOM值都大幅降低，说明种子萌发更加整齐；而MSK 326种子情况相反，经GA3浸种与经清水浸种比较，OMR值却略有降低，说明种子本身活力较高，GA3浸种处理反而影响了其活力，这与出苗率对应结果一致。比较各个呼吸代谢指标、发芽指标与出苗率的相关性，发芽率、发芽指数、IMT相关性正负出现问题，不能正确反映种子出苗情况；而发芽势、OMR、COP、RGT、HOM仍能正确指示种子出苗情况，其中以OMR值相关性最高，相关系数为0.566。

表3不同处理烟草种子呼吸代谢ASTEC值与发芽指标

品种浸种方式含水量(%)5d发芽势(%)7d发芽率(%)发芽指数IMT(h)OMR(%/h)COP(%)RGT(h)HOM出苗率(%)MS云烟85清水3.2596.798.024.3037.741.5533.55126.5074.5345.5GA33.3996.09724.1644.111.9231.84104.4026.2562.0MSK326清水3.7997.79824.4444.652.0129.66100.416.6963.5GA33.5096.096.724.2143.291.8832.62120.494.1347.06云烟97清水3.3999.399.724.8444.321.4334.37270.2124545.5GA34.3398.799.324.746.021.6435.34129.438.7664.5相关系数r0.072-0.04-0.10.6260.566-0.31-0.537-0.52

3　讨论与结论

1) 利用Q 2氧传感技术分析了不同生产年份、不同密度、不同催芽工艺处理烟草种子萌发过程中的呼吸代谢情况，种子呼吸代谢指标尤其是OMR值即氧代速率能够较好的评价烟草种子的活力。对不同生产年份、不同密度种子，OMR值与出苗率在0.01水平呈极显著正相关，相关系数分别为0.847、0.994；对不同催芽工艺处理烟草种子，OMR值与出苗率相关系数为0.566。

2) 对于不同生产年份、不同密度、不同催芽工艺处理烟草种子，利用Q 2氧传感技术提供的呼吸代谢指标来指示烟草种子活力比利用传统发芽指标效果更好，与种子实际出苗率相关性更高。