兔肝肿瘤射频消融术后循环血中T细胞、NK细胞的表达

杨闯 张永川 古广强 何静宇

（绵阳市第三人民医院 四川 绵阳 621000）

引言

射频消融是近年来被广泛用于实体瘤治疗的一种新型微创技术，其在应用时采用超声引导，经电极针向肿瘤中心做定点发射，使肌瘤处于带电状态，在高频交流电的作用下，促使实体瘤内的离子发射高频振动，产生热量，从而达到使肿瘤细胞脱水、凝固、坏死的目的[1]。虽然目前临床中对于射频消融技术治疗效果方面的研究较多，但是关于其对机体免疫功能的影响报道较少。本次研究将通过建立兔肝脏原位种植XV2肿瘤模型，行射频消融治疗（RFA）后，探讨射频消融术对荷瘤兔机体免疫反应的影响情况。

1.资料及方法

1.1 实验动物

研究选取纯种的3～4月龄新西兰大耳兔共28只，体重在2.5～3.5kg之间，雌雄比例不限。所有种兔均为已建立好的长有VX2肿瘤的研究用兔。根据是否进行射频消融治疗，将28只分为对照组（10只）和射频消融组（18只），两组兔子的基本情况和发病情况相似，P＞0.05，具有可对比性。

1.2 主要试剂及仪器

射频治疗采用美国Radio Therapeutics公司生产的RF 2000TM射频治疗系统，射频消融针采用该设备配套射频消融针，应用美国BECKMAN COULTER公司生产的Epics XL型流式细胞仪。血管内皮生长因子受体试剂盒由迈新生物技术有限公司提供，Bcl-2酶联免疫吸附试验试剂盒由北京瑞格博科技有限公司提供。

1.3 标本采集及处理

所有对照组荷瘤兔不进行治疗，射频消融组荷瘤兔在超声引导下行射频消融进行治疗，在射频消融后1周、2周、4周时，采集两组荷瘤兔兔耳部（中央）动脉血10ml，置入肝素抗凝无菌试管内，离心备用。将射频消融组荷瘤兔分别分为三组，分别在术后1周、2周和4周时处死，选取行射频消融治疗后的凝固行坏死组织及其便于1cm组织作为标本，待用。

1.4 实验方法

将采集到的外周血标本应用Epics XL型流式细胞仪，对两组荷瘤兔的T细胞浓度、T细胞活性以及NK细胞比例进行检测。同时采用免疫组化法，应用相应的试剂盒，对两组荷瘤兔Bcl-2和VEGF水平进行检测，检测时严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计处理

采用SPSS20.0统计软件对各组实验数据进行分析，等级资料用秩和检验，计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，计数资料数据以率（%）表示，两组比较用χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2.结果

2.1 T细胞及NK细胞表达

在治疗前，两组荷瘤兔的T细胞亚群和NK细胞表达水平基本接近，P＞0.05，不具有统计学意义。但在治疗后，两组荷瘤兔的各项指标水平具有着明显的差异性，P＜0.05，具有统计学意义，见表1。

表1 两组荷瘤兔治疗前后T细胞亚群和NK细胞水平对比

2.2 VECF和Bcl-2的表达

射频中心损毁区域内无VECF表达，但在残余肿瘤区域内可见VECF表达，射频组荷瘤兔的VECF表达水平明显低于对照组。而对照组荷瘤兔的Bcl-2也明显高于射频消融组，P＜0.05，不具有统计学意义，见表2。

表2 不同时段两组荷瘤兔VECF表达水平分析

图1 Bcl-2免疫组化

3.讨论

VX2肿瘤是一种由Shope病毒所诱导的兔乳头状瘤所衍生出的一种鳞癌[2]。本次研究以肿块预埋发制备出所需的兔肝肿瘤模型，方法简便，可操作性强。射频消融术是近年来被用于实体瘤治疗的一种新型微创治疗技术[3]，利用离子之间相互碰撞产生热量的原理，提高局部温度，从而达到使肿瘤细胞脱水、凝固、坏死的目的[4]。由于射频消融在用于肿瘤治疗是主要是依靠高温原理来杀灭肿瘤细胞，使得病灶组织凝固、坏死，故而其效果类似与手术切除。由于热效应对于机体的免疫力有着良好的促进效果，故而行射频消融治疗能否对机体的免疫功能产生影响，成为近年来临床中研究的一个热门问题。

T临床亚群细胞的平衡情况是维持机体内部免疫系统环境平衡的重要因素，而CD4+/CD8+比值则为机体内部免疫状态是否动态稳定的重要表达指标，如比值过低，则提示机体的免疫能力下降。本次研究结果显示，在未进行治疗前，对照组与观察组各项指标水平是基本接近的（P＞0.05），但在经射频消融治疗后两周左右时，两组荷瘤兔的指标水平明显改善（P＜0.05），但是RFA治疗组的荷瘤兔机体免疫细胞活性呈现小幅上升趋势，而到治疗4周左右时，射频消融组荷瘤兔的免疫细胞活性水平与对照组呈现出明显的差异性，这可能与热效应能够增加荷瘤兔机体免疫能力，经过射频消融治疗后，凝固坏死的肿瘤组织仍然残留在机体内，激活免疫系统以及机体本身肿瘤负荷减少有关。故而我们认为，射频消融术能够通过对肿瘤微血管的破坏作用，控制肿瘤血管的形成，同时还能够提高机体的免疫能力。

4.结论

射频消融技术作为一种新型实体瘤治疗方案，其在用于肝脏肿瘤治疗时，能够显著提高机体的细胞免疫能力，对于延长生存期有着重要的意义，其具体作用机制还需要进一步研究证实。

[1]朱迎,钦伦秀.肝癌免疫生物治疗的现状及评价[J].中国实用外科杂志,2016,14(6)：636-41.

[2]张洪新,刘燕,曹伟,等.兔肝VX2移植癌改良模型的建立[J].肿瘤防治研究杂志,2002,29：1-3.

[3]VARNEY M L，SINGH RK．VEGF-C-VEGF R 3/Flt4 axis regu lates mammary tumor growth and metastasis in an autocrine manner[J].Am J Cancer R es,2015,5(2)：616-628.

[4]Ronnie TP.Prevention of recurrence after resection of hepatocellular carcinoma：A daunting challenge[J].Hepatology,2011,54(3)：757-759．