关节软骨缺损的临床治疗及研究进展

孙祥，张 聘，赵建宁，周利武，张 雷［南京大学医学院附属金陵医院（解放军南京总医院）骨科；南京医科大学金陵临床医学院（解放军南京总医院）骨科，江苏南京000］

0 引言

关节软骨是滑膜关节的弹性负重组织，具有缓冲应力、吸收震荡、减轻摩擦、润滑关节表面等重要作用。当各种原因造成关节软骨损伤时，由于缺乏血供和迁移到损伤部位的未分化细胞，其自身修复能力往往有限［1］。临床上根据国际软骨修复协会（interna⁃tional cartilage repair society，ICRS）分级法对关节软骨损伤进行分级：①直径1.0～2.0 mm的软骨损伤，修复的组织与正常的透明软骨相似；②直径＞3 mm的软骨损伤，又称为关节软骨缺损（articular cartilage de⁃fects，ACD），修复的组织主要为纤维软骨，但是大多不能完全修复；③直径＞6 mm的ACD往往不能自身修复，还会进一步损伤周围骨壁以及周围关节软骨，从而引起周围的软骨下骨及关节软骨的塌陷，最终不可避免的出现骨性关节炎［2］。

膝关节损伤→ACD→骨关节炎这一疾病模式在国际上及我国均常见，目前美国每年因中重度膝关节骨关节炎接受膝关节置换手术的患者已超过140万，而且接受关节置换人数每年都在不断地增长。我国目前尚无详细的数据，但据估计每年接受关节置换的患者约45万。特别是近年来，随着我国医疗保险制度的不断完善，这一数字持续上升。如果可以在ACD时期通过软骨修复阻断这一疾病过程，每年势必将为国家节约大量医疗投入，同时也可减轻患者病痛和经济负担。但遗憾的是，针对ACD的治疗缺乏有效方法。因此本文就ACD的临床治疗及相关研究进展作一综述。

1 第一代修复技术

第一代以自体细胞为主，包括微骨折（1980年）、马赛克移植（1992年）、ACI（1994年）等；第一代技术的主要缺点在于均为有创操作，且取材于自身组织，取样部位依然会出现ACD等。

1.1 微骨折技术（microfracture，MF） MF是最早提出的软骨缺损修复技术，该技术是由 Steadman等在1980年提出，主要原理是微骨折孔道最初的渗血中含有丰富的骨髓间充质干细胞，干细胞能够启动软骨修复机制，分化为软骨细胞填充软骨缺损处［3］。MF主要适用于年轻患者，Sledge等［4］通过临床试验表明60%～80%的骨性关节炎患者通过微骨折手术治疗后能够改善关节功能，缓解疼痛。然而微骨折术后主要形成的为纤维软骨，其生物力学性能差于透明软骨，并且针对较大的软骨缺损，MF的效果并不确切［5］。

1.2 马赛克技术（mosaicplasty） 马赛克技术又称为自体骨软骨移植，该技术主要是将低负重区的骨软骨移植到骨软骨缺损处。马赛克技术主要适用于面积较小（＜2 cm2）的全层软骨缺损病例，移植后受区所形成的软骨光滑有弹性，固定牢固，大约80%的组织成分为透明软骨［6］。虽然自体的骨软骨生物相容性好，但是这种术式损伤了关节其他部位的骨软骨组织，Hangody等［7］通过长期临床研究表明供区骨关节炎的发病率大约为3%。Hunziker等［8］认为，由于骨软骨组织是从关节的低负重区移植到高负重区，其骨软骨的应力情况必然会发生改变，这就有可能影响术后软骨的修复。

1.3 自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI） ACI技术最早是由 Brittberg在1994年提出，首先在关节镜下从关节的低负重区获取软骨细胞，然后在通过体外培养扩增软骨细胞，最后通过关节镜手术把获得的软骨细胞移植到软骨缺损处，并通过骨膜覆盖［9］。ACI主要具有两大优点：其一，使用自己的软骨细胞可以避免潜在的免疫并发症和感染的风险；其二，少量的取样可以减少对患者关节软骨的损伤［10］。然而，ACI的成功实施往往需要两次关节镜手术，并且组织的成熟往往需要很长时间（6～12月左右），操作过程的繁琐与耗时阻碍了ACI技术运用于临床治疗［11］。 Hjelle 等［12］研究表明，虽然ACI技术取样来自于关节非负重区，但是取样区后期仍有发生骨性关节炎的风险。

2 第二代修复技术

第二代修复技术在自体细胞的基础上增加了细胞外基质，包括基质诱导的ACI（MACI，2002年）。第二代技术的主要缺点在于细胞外基质的不确定性，往往导致移植的软骨结构不稳，并且与周围软骨组织无法有效连接，从而导致力学性能下降。

第二代技术认为传统的ACI技术由于缺乏生物支架提供结构性的支持，软骨细胞的再生率有限，而MACI技术首先将体外扩增的软骨细胞种植在一种可吸收性的猪源性混合胶原膜（主要由Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原组成），然后通过纤维蛋白胶固定到软骨缺损处，这种胶原膜作为生物支架能够提供润滑作用，并且有利于软骨细胞的渗透［13］。MACI技术与ACI技术相似，同样需要两次关节镜手术，其操作过程也同样繁琐，不利于临床运用。Bartlett等［14］通过在关节镜下观察 MACI与 ACI治疗的病例组织学结果表明，MACI修复技术移植的软骨细胞有肥大的可能性。

3 第三代修复技术

第三代修复技术运用组织工程的方法，包括NT／ET（软骨块和自然纤维蛋白胶的混合物，Denovo公司，2008年）、CAIS（自体软骨植入系统，Depuy公司，2012年），3D生物打印技术等；第三代技术的主要缺点是其种子细胞来源于同种异体的新生儿脐带血干细胞，存在一定的排异性和疗效不确定性，且价格十分昂贵。

组织工程技术主要致力于在体外或体内（原位）构建与正常关节软骨结构与功能相类似的关节软骨，从而实现关节软骨无创性修复［15］。组织工程修复技术的成功实现主要包括三大关键因素：种子细胞、生物支架、信号分子。种子细胞是组织工程修复技术的基础，通过培养可分化为软骨细胞的干细胞可获得充足的种子细胞，这有利于克服传统治疗技术供体不足的缺点。由于间充质干细胞具有容易获取、自我更新能力强等特点，目前组织工程采用的种子细胞主要为间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞（bone manrrow mesenchymal stemcells，BMSCs）和滑膜间充质干细胞（synovium⁃derived mesenchymal stem cells，SMSCs）等。生物支架同样也是组织工程修复技术的必备条件之一，它为种子细胞提供支持的三维结构，并且可以指导软骨组织的生长过程，从而促成软骨损伤修复［16］。目前生物支架的类型主要包括蛋白质类聚合物、碳水化合物类聚合物、人造聚合物以及前三者的混合聚合物。Lu等［17］认为理想的生物支架除了具有良好的生物相容性、生物可降解性、低毒性，还应该与关节软骨具有良好的整合性。组织工程修复技术中，特异的信号分子在诱导干细胞特异性分化的过程中同样具有至关重要的作用。这些信号分子主要通过刺激软骨细胞蛋白多糖、胶原的合成，抑制基质的降解等作用来促进软骨损伤的修复［18］。

最新的组织工程修复技术主要包括Denovo NT／ET（软骨块和自然纤维蛋白胶的混合物）、CAIS（Depuy自体软骨植入系统）、3D生物打印技术等。Denovo NT／ET自2007年引入临床，并有成功治疗距骨软骨关节炎的病例报告［19］。CAIS技术实质上是ACI技术的进一步发展，Cole等［20］对29例患者的前瞻性随机对照试验中将CAIS与MF相比，基于IKDC和KOOS评分，接受CAIS的患者24个月后较接受MF治疗的患者获得了更好的临床效果。然而这两种技术属于同种异体移植，患者有发生免疫反应和传播疾病的风险［20］。传统的组织工程技术由于种子细胞不能有效地接种到支架材料内，导致无法理想构建三维结构的软骨。最新的研究表明，3D生物打印技术有望克服这一缺陷，Cui等［21］通过将牛股骨髁制成体外骨软骨样缺损模型作为“3D生物纸”，然后以聚乙二醇⁃二甲基乙酰胺聚合物和人软骨细胞混合水凝胶为生物墨水，利用3D生物打印生成软骨，组织学观察显示软骨细胞在水凝胶支架内分布均匀，打印产物表面有较多的蛋白聚糖沉积，且存活率较高。然而通过3D生物打印技术制造的组织工程软骨生物相容性是否良好，生物应力效果如何，这些疑问还有待进一步临床试验证实。

4 在研中的第四代修复技术

上述三代技术共有的缺点是在处理4 mm以上的ACD时效果一般，原因在于上述技术过程无法模拟生理自我修复过程，从而无法形成天然的软骨组织，而移植或形成的软骨组织缺乏和周围软骨的有效整合使得其力学性能出现改变，如压缩后无法回弹、应力分布过于集中造成软骨下骨损伤等。因此规划中的第四代修复技术需要另辟蹊径。研究［22］认为，提高机体自身的软骨修复能力可能是未来之路的突破方向。

4.1 种子细胞 生理状态下，当ACD发生时，滑膜作为干细胞的储存器会移行到关节软骨缺损处，和其他局部细胞一起参与ACD修复过程［23］。基于这一现象，De Bari等［24］在人体滑膜组织中分离出一种具有高度增殖能力，并且可以向多种细胞分化的细胞，经鉴定后命名为SMSCs。SMSCs在表现出一般成体干细胞生物学行为的同时，尚具有高度成软骨分化能力，在体内和体外实验中均表现出了突出的ACD修复能力［25］。 相对于传统的 BMSCs，SMSCs因具有取材方便、对患者创伤小、细胞量大、成软骨能力强等优点有望成为目前最理想的ACD修复种子细胞。

4.2 分化条件 研究［26］表明，在 SMSCs促进软骨细胞增殖与分化的过程中，有多种信号通路参与其中，这些通路主要包括Wnt通路、TGFβ⁃BMPs通路、FGF通路、NF⁃κB通路通路、MAPK通路等，其中较为重要的为 Wnt通路和 TGFβ⁃BMPs通路。 Zhang 等［27］研究表明Wnt通路可促进SMSCs的成软骨化，而介导这一过程主要由Sox4通过lncRNA DANCR激活下游的 CTNNB1⁃β⁃catenin 实现。 在 TGFβ⁃BMPs通路中，Smad4蛋白与磷酸化的 R⁃Smads（包括 Smad2／3 和Smadl／5／8两种）形成复合物，然后Smad蛋白异二聚体迁移入核，并在核中与其相关联的转录因子结合来调节下游基因转录，从而促进软骨细胞的增殖与分化［28］。

4.3 LncRNA在其中的作用 SMSCs参与ACD修复的关键点在于促进其向软骨细胞增殖和分化。近来年，研究［29］表明多种长链非编码 RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）参与了这一过程。lncRNA是一类缺乏蛋白质编码功能的RNA，其转录本长度超过200个核苷酸［30］。 近期的研究［31］认为这是一类重要的调节分子，参与许多重要的生物学功能，在表观遗传水平、转录水平、翻译水平、蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控细胞分化的作用。在调控软骨代谢方面，lncRNA的主要机制如下。①直接断裂为microRNA发挥调控作用。有研究［32］表明 lncRNA⁃H19作为前体可通过经典的Drosha⁃Dicer拼接方式产生miR⁃675，miR⁃675可作用于组蛋白去乙酰化酶3’非翻译区（HDAC）4、5、6 转录本，调控骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。②通过microRNA发挥调控作用。 研究［33］发现 lncRNA⁃DANCR（differentiationantagonizing non⁃protein coding RNA，DANCR）可通过与 CTNNB1 相互作用，阻断下游 miR⁃214、miR⁃320a和miR⁃199a对CTNNB1的抑制作用，而进一步研究证实 CTNNB1／β⁃catenin可经 Wnt通路促进 SMSCs向软骨细胞分化。③通过转录因子调控软骨的分化。有研究表明上调lncRNA⁃HIT可直接调节p100／CBP的活性从而促进成软骨［34］，上调 lncRNA⁃MAEL可直接调节OCT4、SOX2进而调节软骨代谢［35］。④通过作为竞争性内源性RNA发挥调控作用。研究［36］发现lncRNA⁃MSR可以作为 miR⁃152的竞争性内源RNA，抑制TMSB4的表达，增加基质金属蛋白酶的表达，参与细胞外基质的降解，导致细胞骨架的破坏，从而造成ACD。基于lncRNA在软骨增殖分化过程中的调控机制，未来如果能发现这一过程中的关键调节点，将有望通过这一关键点实施临床干预，进而通过增强软骨自身的代谢真正实现软骨缺损的修复。

5 展望

根据目前的组织工程修复技术，主要是通过体外获得的软骨来修复损伤的关节软骨，如果未来能够在体内实现关节软骨损伤的修复，即关节软骨损伤的原位修复，或许能突破目前种种修复方案的弊端，真正实现关节软骨损伤的修复。结合目前最新的研究进展，本综述作者预测未来可能有如下两种发展方向。①通过研究体内软骨自我修复的生理过程，是否能够找到促进软骨修复的主要通路，并找到影响这些通路的因素（例如lncRNA⁃DANCR），最终真正实现软骨损伤的原位修复；②通过研究软骨损伤过程，是否能够找到引起软骨退变的通路，如若能够阻断这一通路，就能阻断或减缓ACD的发生，从而从本质上实现对关节软骨损伤的修复。当然这些构想还有待广大研究学者的进一步研究，希望未来能真正实现从关节软骨损伤的原位修复，进而为广大骨性关节炎的患者带来福音！

［1］胥少汀，葛宝丰，徐印坎，等.实用骨科学［M］.人民军医出版社，2015，10（4）：1676－1678.

［2］Mithoefer K，Acuna M.Clinical outcomes assessment for articular cartilage restoration［J］.J Knee Surg，2013，26（1）：31－40.

［3］Kraeutler MJ，Belk JW，Purcell JM，et al.Microfracture versus autologous chondrocyte implantation for articular cartilage lesions in the knee： a systematic review of 5⁃year outcomes［J］.Am J Sports Med，2018，46（4）：995－999.

［4］Sledge SL.Microfracture techniques in the treatment of osteochondral injuries［J］.Clin Sports Med，2001，20（2）：365－377.

［5］Bae DK，Yoon KH，Song SJ.Cartilage healing after microfracture in osteoarthritic knees ［J］.ArthroScopy，2006，22（4）：367－374.

［6］Di Benedetto P，Citak M，Kendoff D，et al.Arthroscopic mosaicplasty for osteochondral Lesions of the knee：computerassisted navigation versus freehand technique［J］.Arthroscopy，2012，28（9）：1290－1296.

［7］Hangody L，Dobos J，Baló E，et al.Clinical experiences with autologous osteochondral mosaicplasty in an athletic population：a 17⁃year prospective multicenter study［J］.Am J Sports Med，2010，38（6）：1125－1133.

［8］Hunziker EB.Articular cartilage repair： basic science and clinical progress.A review of the current status and prospects［J］.Osteoarthritis Cartilage，2002，10（6）：432－463.

［9］Komárek J，Vališ P，Repko M，et al.Treatment of deep cartilage defects of the knee with autologous chondrocyte transplantation： long⁃term results［J］.Acta Chir Orthop Traumatol Cech，2010，77（4）：291－295.

［10］Saris DB，Vanlauwe J，Victor J，et al.Treatment of symptomatic cartilage defects of the knee：characterized chondrocyte implantation results in better clinical outcome at 36 months in a randomized trial compared to microfracture［J］.Am J Sports Med，2009，37（Suppl 1）：10S－19S.

［11］Macmull S，Parratt MT，Bentley G，et al.Autologous chondrocyte implantation in the adolescent knee［J］.Am J Sports Med，2011，39（8）：1723－1730.

［12］Hjelle K，Solheim E，Strand T，et al.Articular cartilage defects in 1，000 knee arthroscopies［J］.Arthroscopy，2002，18（7）：730－734.

［13］Zheng MH，Willers C，Kirilak L，et al.Matrixinduced autologous chondrocyte implantation （MACI）： biologicaland histological assessment［J］.Tissue Eng，2007，13（4）：737－746.

［14］Bartlett W，Skinner JA，Gooding CR，et al.Autologous chondrocyte implantation versus matrixinduced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee： a prospective，randomised study［J］.J Bone Joint Surg Br，2005，87（5）：640－645.

［15］Wakitani S，Kawaguchi A，Tokuhara Y，et al.Present status of and future direction for articular cartilage repair［J］.J Bone Miner Metab，2008，26（2）：115－122.

［16］Khan IM，Gilbert SJ，Singhrao SK，et al.Cartilage integration：evaluation of the reasons for failure of integration during cartilage repair.A review［J］.Eur Cell Mater，2008，16：26－39.

［17］Lu HH，Subramony SD，Boushell MK，et al.Tissue engineering strategies for the regeneration of orthopedic interfaces［J］.Ann Biomed Eng，2010，38（6）：2142－2154.

［18］Oda K，Mori K，Imai S，et al.Comparison of repair between cartilage and osteocartilage defectsin rabbits using similarly manipulated scaffold⁃free cartilage⁃like constructs［J］.Orthop Sci，2014，19（4）：637－645.

［19］Kruse DL，Ng A，Paden M，et al.Arthroscopic De Novo NT（®）juvenile allograft cartil⁃age implantation in the talus： a case presentation［J］.J Foot Ankle Surg，2012，51（2）：218－221.

［20］Cole BJ，Farr J，Winalski CS，et al.Outcomes after a single⁃stage procedure for cell⁃based cartilage repair： a prospective clinical safetytrial with 2⁃year follow⁃up［J］.Am J Sports Med，2011，39（6）：1170－1179.

［21］Cui X，Breitenkamp K，Finn MG，et al.Direct human cartilage repair using three⁃dimensional bioprinting technology［J］.Tissue Eng Part A，2012，18（11－12）：1304－1312.

［22］Fellows CR，Matta C，Zakany R，et al.Bone marrow and synovial joint－derived mesenchymal stem cells for cartilage repair［J］.Front Genet，2016，7：213.

［23］Tao SC，Yuan T，Zhang YL，et al.Exosomes derived from miR⁃140⁃5p⁃overexpressing human synovial mesenchymal stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model［J］.Theranostics，2017，7（1）：180－195.

［24］De Bari C，Dell'Accio F，Tylzanowski P，et al.Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane［J］.Arthritis Rheum，2001，44（8）：1928－1942.

［25］Pan JF，Li S，Guo CA，et al.Evaluation of synovium⁃derived mesenchymal stem cells and 3D printed nanocomposite scaffolds for tissue engineering［J］.Sci Technol Adv Mater，2015，16（4）：045001.

［26］Chang CH，Chen CC，Liao CH，et al.Human acellular cartilage matrix powders as a biologi－ cal scaffold for cartilage tissue engineering with synovium－derived mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Mater Res A，2014，102（7）： 2248－2257.

［27］Zhang L，Chen S，Bao N，et al.Sox4 enhances chondrogenic differentiation and proliferation of human synovium⁃derived stem cell via activation of long noncoding RNA DANCR［J］.Mol Histol，2015，46（6）：467－473.

［28］Kim DR，Kim HY，Park JK，et al.Aconiti lateralis preparata radix activates the proliferation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells and induces osteogenic lineage differentiation through the bone morphogenetic protein⁃2／smad⁃dependent runx2 pathway［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：586741.

［29］Xue C，Zhang L，Shuang F，et al.Robust revascularization，despite impaired VEGF production，after meniscus allograft transplantation in rabbits［J］.Am J Sports Med，2013，41（11）：2668－2675.

［30］Ghosal S，Das S，Chakrabarti J.Long noncoding RNAs： new players in the molecular mechanism for maintenance and differentiation of pluripotent stem cells［J］.Stem Cells Dev，2013，22（16）：2240－2253.

［31］Zhou CC，Yang F，Yuan SX，et al.Systemic genome screening identified the outcome associated focal loss of long noncoding RNA PRAL in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2016，63（3）：850－863.

［32］Huang Y，Zheng Y，Jin C，et al.Long Non⁃coding RNA H19 Inhibits Adipocyte Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells through Epigenetic Modulation of Histone Deacetylases［J］.Sci Rep，2016，28（6）：28897.

［33］Yuan SX，Wang J，Yang F，et al.Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepression of CTNNB1［J］.Hepatology，2015，63（2）：499－511.

［34］Carlson HL，Quinn JJ，Yang YW，et al.LncRNA⁃HIT functions as an epigenetic regulator of chondrogenesis through its recruitment of p100／CBP complexes［J］.PLoS Genet，2015，11（12）：e1005680.

［35］Beeravolu N，Khan I，McKee C，et al.Isolation and comparative analysis of potential stem／progenitor cells from different regions of human umbilical cord［J］.Stem Cell Res，2016，16（3）：696－711.

［36］Liu Q，Hu X，Zhang X，et al.The TMSB4 Pseudogene lncrna functions as a competing endogenous RNA to promote cartilage degradation in human osteoarthritis［J］.Mol Ther，2016，24（10）：1726－1733.