蓝莓嫩茎不同提取物抗氧化能力的比较研究

刘静 李晓英

摘 要：该研究以蓝莓嫩茎为原料，分别使用水、甲醇和乙醇3种提取剂，在固定条件下（提取温度70℃、提取时间1h、料液比为1∶20g/mL、提取剂浓度为70%），对蓝莓嫩茎的多酚类物质进行提取，研究不同提取剂对蓝莓嫩茎粗多酚类和粗黄酮类的提取效率差异，并在设置的浓度梯度下，对3种提取液的抗氧化活性进行了比较。结果表明，在相同的条件下，乙醇作为提取剂的提取效果最好，甲醇次之，水相对最差。同样地，在还原力、羟基清除能力、DPPH清除能力、总抗氧化能力4个方面，3种提取液的顺序皆为：乙醇>甲醇>水。因此，乙醇作为提取剂可对蓝莓嫩茎的抗氧化活性有最大程度的保留，可用于天然抗氧化物的开发和利用。

关键词：蓝莓嫩茎；提取；多酚；黄酮；抗氧化活性

中图分类号 TS255.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0020-04

Comparison of Antioxidant Capacity of Different Extracts from Blueberry Leaves Tender Stem

Liu Jing et al.

（College of Forestry and Life Science，Chongqing University of Arts and Science，Chongqing 402160，China）

Abstract：With comminuted blueberry leaves tender stem as raw material，using the water，methanol and ethanol three kinds of extraction agent，in a fixed condition （extracting temperature 75 ℃，extracting time 1 h，ratio of solid-liquid 1∶20g/mL and extraction agent concentration 50%），extracting the polyphenols and flavonoids from blueberry leaves tender stem and the extraction efficiency of polyphenols and flavonoids from blueberry leaves tender stem with different extracting agents were researched，the antioxidant activity of hree kinds of extract were evaluated in the fixed concentration gradient. The extraction effect of ethanol is the best as a extraction agent，methanol is the second and the water is the worst under the same conditions.Similarly，the reducing power，hydroxyl radical scavenging ability，DPPH scavenging abilities，total antioxidant capacity of three kinds of extract are all decreased in the order of ethanol>methanol> water. Experimental results showed that ethanol could preserve the antioxidant activity of blueberry leaves tender stem to the maximum extent as an extraction agent，which could be used for the development and utilization of natural antioxidants.

Key words：Blueberry tender stem；Extract；Polyphenol；Flavone；Antioxidant activity

藍莓，属杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实中有大量的黄酮、多酚、花青素等活性物质，且有较高的抗氧化活性，但其昂贵的价格限制了蓝莓的广泛应用，进而人们把注意力转移到蓝莓叶上[1]。蓝莓叶中含有粗纤维、粗蛋白、脂肪酸、萜类、甾醇、矿质元素、有机酸、氨基酸、糖类、维生素和大量多酚类化合物。作为一种药用植物，蓝莓以叶入药，性温、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于风湿、痛风[2]。蓝莓叶中含有丰富的多酚类和黄酮类化合物，大量研究证明，多酚类和黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症等广泛的生物活性[3]。目前，市场上的抗氧化剂主要分为天然抗氧化剂和化学合成抗氧化剂。由于化学合成抗氧化剂具有一定的毒性、致畸性和潜在的致癌性，使用过多会对人体健康造成重大危害。因此，寻找安全、高效的天然抗氧化剂成为近年来的一大研究热点。天然抗氧化剂主要来源于植物，具有化学合成抗氧化剂所没有的诸多优点[4]。因此，将蓝莓进行综合利用，既能产生很好的经济效益，又能减少环境污染[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 蓝莓叶嫩茎：重庆文理学院星湖校区黄瓜山产，蓝莓品种为南金3#（兔眼高丛蓝莓），树龄3a；经40℃烘干8～10h使水分含量低于8%以下，粉粹过60目筛密封-80℃保藏备用。实验前将样品置于干燥器中平衡过夜。DPPH、ABTS采购于上海金穗生物科技有限公司，其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备 RRH-200型高速多功能粉粹机：上海缘沃工贸有限公司；FA2104电子天平：上海精科天平有限公司；DK-98-I电子恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；RZ-50高速微量离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；754型紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平开学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓叶水提取物的制备 准确称取1g试样，于150mL锥形瓶中，加入酸化过的水20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出搖晃1次。浸提液经抽提过滤并定容至50mL，做3次平行实验。

1.3.2 乙醇提取物的制备 准确称取1g试样，于150mL锥形瓶中，加入酸化过的70%乙醇20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出摇晃1次。浸提液经抽提过滤并定容至50mL，做3次平行实验。

1.3.3 甲醇提取物的制备 准确称取1g磨碎试样，于150mL锥形瓶中，加入酸化过的70%甲醇20mL，置于70℃水浴中浸提1h，每15min取出摇晃1次。提液经抽提过滤并定容至50mL，做3次平行实验。

1.3.4 提取物多酚含量的测定[6] 取1mL试液于25mL的容量瓶中，再加入1mL经稀释过的Folin-Ciocalteu试剂，用7.5%的碳酸钠溶液定容至刻度，摇匀，在765nm处，用1cm比色皿，试剂空白作参比，测定吸光度。根据蓝莓叶嫩茎的总多酚平均含量按下列公式计算：y=3.99x+0.0913。其中：y为吸光度值；x为多酚含量（mg/mL）。

1.3.5 提取物黄酮含量的测定[7] 分别取样液2mL、加入1mL5%的亚硝酸钠混匀，6min后加入1mL10%硝酸铝，6分钟后加10mL4%氢氧化钠混匀，用去离子水定容到25mL，静置15min，反应液充分混匀，15min后在510nm波长处测定吸光度。蓝莓叶嫩茎的总黄酮平均含量按下列公式计算：y=0.4772x+0.0406。其中：y为吸光度值；x为黄酮含量（mg/mL）。

1.3.6 抗氧化能力的测定

1.3.6.1 铁离子还原力的测定[8] 1mL提取液中加入2.5mLPH6.6浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲液（即磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲液pH6.6）以及2.5mL质量分数为1%的K3Fe（CN）6溶液，于50℃水浴中反应20min后迅速冷却，并加入2.5mL质量分数为10%的三氯乙酸（TCA）溶液，以3000r/min离心10min后取上清液2.5mL，并加入2.5mL蒸馏水以及0.5mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀，10min后于700nm处测定气吸光度。空白组以等体积的样液提取溶剂代替样液；以抗坏血酸作为阳性对照。还原力按如下公式计算：还原力=A-A0。其中，A为混合液的吸光度值；A0为体积的样液提取溶剂代替样液所得吸光度值。

1.3.6.2 清除羟基自由基的能力测定[9] 向试管中加入1.00mL不同浓度的样液，1mL10mmol/L硫酸亚铁，1mL10mmol/L水杨酸-乙醇，1mL8.8mmol/L的H2O2，震荡反应，37℃水浴30min，以蒸馏水调零于510nm处测定吸光值，以抗坏血酸作为阳性对照。羟自由基清除率计算公式为：

[D（%）=A0-（A1-A2）A0×100]

式中：A0为蒸馏水代替样液作为空白管吸光度，A1为样品管吸光度，A2为不加显色剂H2O2样品溶液的吸光度。

1.3.6.3 清除DPPH自由基的测定[10] 分别量取不同浓度的提取液2mL及2mL的DPPH溶液（0.2mmol/L，该溶液避光保存温度为4℃，现用现配，19.7mgDPPH用少量乙醇溶解，再定容至250mL，低温避光保存，并于3.5h内用完）加入同一试管中，摇匀后，在37℃暗处放置30min，分别在517nm波长处测定吸光度，以抗坏血酸作为阳性对照。根据公式计算其清除率：

[清除（%）=[1-Ai-AjA0]×100]

式中：Ai为加入2mL不同质量浓度的样品溶液后DPPH溶液的吸光度；Aj为加入2mL不同质量浓度样品溶液和2mL乙醇的吸光度；A0为加入乙醇后DPPH溶液的吸光度。

1.3.6.4 ABTS自由基清除法测定总抗氧化能力[11] 在浓度为7mmol/L的ABTS溶液中加入过硫酸钾使其终浓度为2.45mmol/L，充分混合均匀，将混合反应液在室温避光的条件下放置12～16h（ABTS反应液须新鲜配制，保留的最长时间为3d）。在EP管中加入200μL样品溶液，300μL的ABTS反应液，然后加入0.5mL50%甲醇溶液，充分振荡均匀，反应2min后，在745nm处测定吸光度。以不加样品为空白对照，以抗坏血酸作为阳性对照，对ABTS自由基的清除率按以下式子来计算：

[清除率（%）=A0-AsA0×100]

式中：A0为空白样品吸光度；AS为待测样品吸光度。

1.3.7 数据处理与分析 用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 多酚和黄酮的含量 分别按照1.3.1至1.3.5所述方法，蓝莓嫩茎水、乙醇、甲醇3种提取物的多酚和黄酮含量结果见表1。由表1可以看出，在相同条件下，水、乙醇和甲醇作为提取剂，从样品中提取多酚含量乙醇>甲醇>水，提取的黄酮含量也是乙醇>甲醇>水。而在这3种提取液中，黄酮含量都明显大于多酚含量。

2.2 3种提取液及对应浓度Vc铁离子还原力比较 使用提取液原液及其稀释2倍、4倍、8倍、16倍的提取液，其以原料质量分数为基础的样品浓度分别为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL，比较不同提取剂所提取溶液的还原力，结果见图1。通过图1可以看出，在相同浓度下，Vc溶液的铁离子还原力均高于3种提取液，而在3种提取液中，乙醇提取液的铁离子还原力高于甲醇提取液，而甲醇提取液的铁离子还原力高于水提液。另外，这3种提取液及Vc溶液的铁离子还原力，都随着浓度的减小而呈下跌趋势，而3种提取液还原力的差异也随着浓度的减小而减小，在样品浓度为20mg/mL时有最大差异，其中水提液的还原力为1.06，甲醇提取液的还原力为1.60，乙醇提取液为1.94；在样品浓度为1.25mg/mL时的差异最小，水提液、甲醇提取液和乙醇提取液的还原力分别为0.07、0.09、0.11。

2.3 3种提取液及对应浓度Vc清除羟基自由基的能力比较 使用浓度为0.6g/mL的提取液液及其稀释2倍、4倍、8倍、16倍的提取液，其以原料质量分数为基础的样品浓度分别为60mg/mL、30mg/mL、15mg/mL、7.5mg/mL、3.75mg/mL。按照1.3.2.2所述方法，比较不同提取剂所提取溶液的羟基清除能力，结果见图2。从图2可以看出，在相同浓度下，Vc溶液的羟基自由基清除能力均高于3种提取液，而在这3种提取液中，乙醇提取液的羟基自由基清除能力强于甲醇提取液和水提溶液，而水提取液在样品浓度7.5mg/mL及以上时的羟基自由基清除能力强于甲醇提取液，在样品浓度为3.75mg/mL时却弱于甲醇提取液。另外，3种提取液及Vc溶液的羟基自由基清除能力，都随着浓度的减小而呈下跌趋势，且3种提取液的羟基自由基清除能力差异，也随着样品浓度的减小而呈增大趋势，在样品浓度为60mg/mL时，3种提取液无太大差异，其中水提液的还原力为78.54%，甲醇提取液的还原力为77.32%，乙醇提取液为79.79%；在样品浓度为3.75mg/mL时的差异最大，水提液、甲醇提取液和乙醇提取液的还原力分别为21.59%、27.90%、42.85%。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物质的量相对最大，且浓度的稀释，对其抗氧化性影响相对最小。

2.4 3种提取液及对应浓度Vc的DPPH自由基清除能力比较 使用提取液原液及其稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的提取液，其以原料质量分数为基础的样品浓度分别为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。按照1.3.2.3所述方法，比较不同提取剂所提取溶液的DPPH清除能力，结果见图3。通过图3可知，在相同浓度下的Vc溶液和这3种提取液中，乙醇提取液的DPPH自由基清除能力强于甲醇提取液、水提溶液和Vc溶液，甲醇提取液强于水提溶液和Vc溶液，而Vc溶液的DPPH自由基清除能力强于水提取液。另外，这3种提取液提取液和Vc溶液的DPPH清除能力，随着浓度的减小而呈下跌趋势。在样品浓度在5mg/mL以上时，3种提取液和Vc溶液的DPPH清除能力无明显差异，且均在90%以上，具有较强的DPPH清除能力；在样品浓度稀释到2.5mg/mL时，水提取液的DPPH清除能力开始明显下降，而甲醇提取液、乙醇提取液和Vc溶液的DPPH清除能力仍无明显变化；在样品浓度稀释到1.25mg/mL时，甲醇提取液和Vc溶液的DPPH清除能力开始明显下降，而乙醇提取液的DPPH清除能力仍无明显变化；在样品浓度稀释到0.625mg/mL时，乙醇提取液的DPPH清除能力开始明显下降。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物质的量相对最大，且浓度的稀释，对其抗氧化性影响相对最小。

2.5 3种提取液及对应浓度Vc的总抗氧化能力比较 使用提取液原液及其稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍的提取液，其以原料质量分数为基础的样品浓度分别为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。按照1.3.2.4所述方法，比较不同提取剂所提取溶液的总抗氧化能力，结果见图4。通过图4可知，在相同浓度下的Vc溶液和这3种提取液中，乙醇提取液的总抗氧化能力强于甲醇提取液、水提溶液和Vc溶液，甲醇提取液则强于水提溶液和Vc溶液，而Vc溶液的总氧化能力强于水提取液。另外，这3种提取液和Vc溶液的总抗氧化能力，均随着浓度的减小而呈下跌趋势。在样品浓度在5mg/mL以上时，3种提取液和Vc溶液的总抗氧化能力无明显差异，且清除率均接近于100%；当提取液稀释到2.5mg/mL时，水提取液和Vc溶液的清除率开始明显下降，而甲醇提取液和乙醇提取液的清除率仍无明显变化；当提取液稀释到1.25mg/mL时，甲醇提取液的清除率开始明显下降，而乙醇提取液的清除率仍无明显变化，保持在接近于100%的清除率。直到提取液稀释到0.625mg/mL时，乙醇提取液的清除率才开始明显下降。由此可以看出，乙醇提取液所含抗氧化物质的量相对最大，且浓度的稀释，对其抗氧化性影响相对最小。

3 结论

水、乙醇和甲醇分别作为提取剂，在蓝莓叶嫩茎中提取多酚和黄酮的效率具有显著性差异，在相同条件下，乙醇提取液中所含多酚和黄酮的含量都是最高的，其次是甲醇提取液，水提取液所含多酚和黄酮含量最低。另外，这3种提取液中，黄酮的含量均大于多酚含量。

用抗坏血酸作阳性对照，通过4个方面评价水、乙醇和甲醇作为提取剂所得提取液的抗氧化能力。在铁离子还原力和羟基清除能力2个方面，Vc溶液的表现强于3种提取液；而在DPPH清除能力、总抗氧化能力2个方面，这3种提取液和Vc溶液的表现顺序为乙醇提取液>甲醇提取液>Vc溶液提取液>水提取液。而在3种提取液中，在鐵离子还原力、DPPH清除能力和总抗氧化能力3个方面，乙醇提取液所表现的抗氧化能力最强，且随着浓度的稀释乙醇提取液保持抗氧化性的的能力也是最强的，其次是甲醇提取液，水提取液在这3个方面的抗氧化能力表现相对最差。而在羟基清除能力上，乙醇提取液所表现的抗氧化能力仍然是最强的，且浓度的稀释对其影响最低，在实验所设置的浓度梯度中，除了最低浓度，水提取液的羟基清除能力强于甲醇提取液。

根据本次实验结果可以得知，乙醇是最适合作为提取蓝莓叶嫩茎抗氧化物质的提取剂，其所得提取液保留了相对最大化的抗氧化能力，且其提取液随着浓度的稀释，抗氧化能力的保持能力最强。乙醇作为提取剂，具有开发天然抗氧化产品的价值。

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