绿藻中提取的硫酸鼠李糖对酶的抑制作用研究

张洋

摘 要：该文研究了从太平洋沿岸、浙江沿海地区的天然绿藻中提取硫酸化多糖的高效方法。通过对比盐酸处理法、酶处理法、高温加热酶处理法提取硫酸鼠李糖的得率，高温加热酶处理法最为高效。其次该种硫酸化多糖对各种生物酶的活性抑制实验表明，硫酸鼠李糖对透明质酸酶和弹性蛋白酶的活性抑制能力较强，对胶原蛋白酶活性无抑制作用，对络氨酸酶活性有一定抑制作用。证明绿藻中提取的硫酸鼠李糖对于人体的保湿性能、抗黑色素生成性能以及维持肌肤弹性方面均有作用，为其今后在护肤品行业和健康保健食品方面的发展提供理论基础。

关键词：绿藻；硫酸化多糖；硫酸鼠李糖；生物活性酶；酶的抑制作用

中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0011-03

Research on Enzyme Inhibition of Rhamnan Sulfate from Monostroma nitidum

Zhang Yang

（Wuhu Institute of Technology，Wuhu，241003，China）

Abstract：This paper studies the efficient method of extracting sulfated polysaccharide from the natural algae（Monostroma nitidum） from the Pacific coast and Zhejiang coastal areas. The author compared the receiving rates of rhamnan sulfate extracted respectively by means of hydrochloric acid treatment，enzyme treatment，and high-temperature heating enzyme treatment and concludes that the third method is the most efficient. In the next place，the experiment to study the inhibition effect of such sulfated polysaccharide on the activity of various bio-enzymes suggests that rhamnan sulfate has a relatively strong inhibiting ability on the activity of hyaluronidase and elastase，but exerts no inhibiting effect on the activity of collagenase，and has a certain inhibiting impact on the activity of tyrosinase. This proves that rhamnan sulfate extracted from the algae plays a certain role in moisturizing human body，preventing the production of melanin and maintaining skin elasticity，which provides a theoretical basis for its future development in skin care industry and dietary supplement.

Key words：Monostroma nitidum；Sulfated polysaccharides；Rhamnan sulfate；Bioactive enzyme；Enzyme inhibition

硫酸化多糖也称多糖硫酸脂或硫酸脂多糖，是指糖羟基上带有硫酸根的多糖，主要来源天然提取和化学合成。据以往的研究[1]，绿藻中存在大量含有硫酸基的多糖物质。硫酸化多糖有硫酸软骨素（chondroitin sulfate）、岩藻多糖（fucoidan）、香菇多糖（lentinan）等，存在于海藻、动植物体内，这些硫酸化多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗癌、治愈外伤等多种生理活性作用。早在1982年，日本Sugawara等[2]发现某些匀多糖的硫酸脂如卡拉胶是一种有效的淋巴細胞的促细胞分裂源，Nakashima等[3]发现卡拉胶和肝素等还具有抑制疱疹病毒复制的作用。但是如果将这些多糖的硫酸根除去，则这些活性都将消失[4]。日本学者对多种海藻中提取的各种硫酸化多糖的研究表明，这些硫酸化多糖的活性随多糖的分子量及硫酸根的含量而变化，一般认为多糖分子量在5000～60000，硫酸根含量在每单位糖残基平均含1.5～2.0为最佳。目前为止，日本和法国对绿藻多糖的研究报道较多[5]，而我国对绿藻多糖的研究较少。大量的研究表明，从绿藻中提取的天然多糖，来源广泛，品种多，毒副作用低，安全性能高，具有多种生物活性。

随着人民生活水平的提高，绿藻中提取的天然硫酸化多糖在化妆品及生物制药领域的应用势必将成为近年来研究开发的热点。本研究将解决如何简单高效的从浙江沿海的一种绿藻中提取一种名为硫酸鼠李糖（rhamnan sulfate）的硫酸化多糖。这种绿藻主要分布在我国南部各沿海省份，另外从日本本州的太平洋沿岸到九州、南西诸岛以及朝鲜半岛都有较多分布，在冬季从初夏潮间带的岩上生长，为长度4～10cm的叶状。

以往对硫酸化多糖生物活性的研究大多集中在医疗领域，主要表现在它的抗凝血作用、抗肿瘤、抗病毒、抗HIV活性，这些硫酸化多糖大部分提取自动植物组织内。而本研究着眼于从绿色海藻中提取硫酸化多糖，并主要分析其对于人体的保湿、抗黑色素生成、以及维持肌肤弹性性能的影响。

透明质酸具有保湿、高粘性、修复炎症等性质。而透明质酸会被透明质酸酶水解，随着年龄的增长，体内透明质酸的量会减少。所以抑制透明质酸酶的活性或者使透明质酸酶活性低下，就可以使透明质酸保持一定量不流失，维持皮肤的健康状态。抑制透明质酸酶的活性，会对人体皮肤的保湿方面起到积极作用。而对胶原蛋白酶的活性抑制将会阻止胶原蛋白被水解，对络氨酸酶的活性抑制会使得黑色素的生成受到阻碍，抑制弹性蛋白酶的活性可使得肌肤保持弹性。本研究主要探讨了从绿藻中提取的硫酸鼠李糖对这些酶的活性的抑制程度。

1 材料与主要仪器

1.1 材料 浙江沿海产绿藻；p-DABA，日本和光纯药株式会社；EDTA，日本和光纯药株式会社；Compound48/80，日本Sigma会社。

1.2 主要仪器 台式高速离心机TG16-W，长沙湘智离心机仪器有限公司；恒温振荡器HZ-C，太仓市实验设备厂；超声波清洗机XO-3200DT，南京先欧仪器制造有限公司；电子天平BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司；紫外可见分光光度计UV-1800，日本岛津公司；高速大容量冷却离心机7780Ⅱ，日本久保田公司。

2 研究方法

2.1 绿藻中提取硫酸鼠李糖

2.1.1 盐酸处理法 20g干燥海藻粉末加蒸馏水600mL溶解，1M盐酸调制溶液pH至3.0，60℃、3h搅拌。用硅藻土过滤后，加0.5MNaOH中和，加乙醇溶解，得到沉淀物，用蒸馏水再溶解，再次乙醇溶解，回收沉淀物，用超纯水再溶解，透析膜经过20h透析，将透析膜内液冻结干燥后，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.1.2 酶处理法 20g干燥海藻粉末加蒸馏水600mL溶解，加纤维素酶0.2g，45℃、24h搅拌。之后操作与酸处理法相同，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.1.3 高温加热酶处理法 20g干燥海藻粉末加蒸馏水600mL溶解，高温灭菌锅121℃、15min加热灭菌，室温冷却后，加纤维素酶0.2g，45℃、24h搅拌。之后操作与酸处理法相同，得到精制硫酸化多糖粉末。

2.2 硫酸鼠李糖对生物酶的活性抑制实验

2.2.1 对透明质酸酶活性抑制实验 透明质酸酶溶液50μL添加至100μL硫酸鼠李糖（RS）样品中，37℃、20min恒温振荡反应。添加活性化溶剂Compound48/80溶液100μl，37℃、20min恒溫振荡反应。添加透明质酸钠溶液250μl，37℃、40min恒温振荡反应。添加0.4M氢氧化钠溶液100μl后反应中止，添加硼酸溶液100μL，3min水浴煮沸。冷却至室温后，添加p-DABA溶液3mL，37℃、20min恒温振荡反应。波长585nm下测定溶液吸光度。

2.2.2 对胶原蛋白酶活性抑制实验 胶原蛋白酶溶液50μL添加至50μL硫酸鼠李糖（RS）样品中，添加Pz-肽（Pz-pro-leu-Gly-pro-D-Arg）溶液400μL，37℃、30min恒温振荡反应。添加25mM柠檬酸溶液1mL后反应停止。然后添加乙酸乙酯溶液5mL，激烈振动试管，离心机3000rpm、10min离心分离，取乙酸乙酯层在波长320nm下测定溶液吸光度。

2.2.3 对络氨酸酶活性抑制实验 硫酸鼠李糖（RS）样品0.9mL中添加0.3mg/mL络氨酸溶液300μL、0.1M磷酸缓冲溶液（pH6.8）1mL，37℃、10min恒温振荡反应。再添加络氨酸酶溶液100μL，37℃、40min恒温振荡反应。添加2M叠氮化钠溶液后反应停止，波长475nm下测定溶液吸光度。

2.2.4 对弹性蛋白酶活性抑制实验 弹性蛋白酶溶液25μL添加至50μL硫酸鼠李糖（RS）样品中，放置冰箱中4℃条件下15min反应添加8mM基质（N-Methoxysuccinyl-L-Alanine-L-Alanine-L-Prolyl-L-Valine-p-Nitroanilide）溶液25μL，室温下30min放置反应，波长405nm下测定溶液吸光度。

3 结果与分析

3.1 绿藻中提取硫酸鼠李糖 表1对比3种方法从绿藻中提取硫酸鼠李糖的得率，最高的为高温加热酶处理法。

表1 不同方法从绿藻中提取硫酸鼠李糖的得率

[提取方法 得率（%） 盐酸处理法 20 酶处理法 16 高温加热酶处理法 28→24* ]

注：高温加热酶处理得到的硫酸鼠李糖得率为28%，碘与淀粉反应测试出提取物中还含有淀粉成分，固用淀粉酶分解淀粉后的得率为24%。

3.2 硫酸鼠李糖对生物酶的活性抑制

3.2.1 对透明质酸酶活性抑制 测得的吸光度数值根据下列公式计算对酶活性的抑制率：

[抑制活性（%）=1-（S-SB）（C-CB）×100]

式中：S：样品；SB：空白试样；C：对照组；CB：空白对照。

标准物质0.7mg/mL浓度的cromolyn溶液对透明质酸酶抑制活性为71.34%，0.7mg/mL样品溶液对透明质酸酶抑制活性为25.16%，相比较标准物质较弱，说明硫酸鼠李糖对透明质酸酶活性有抑制作用。

3.2.2 对胶原蛋白酶活性抑制 测得的吸光度数值根据同上公式计算对酶活性的抑制率，标准物质EDTA溶液浓度0.025M（9.3mg/mL）对胶原蛋白酶抑制活性为70.95%，1.0mg/mL、5.0mg/mL、10.0mg/mL样品溶液对透明质酸酶抑制活性均为0%，说明硫酸鼠李糖对胶原蛋白酶活性没有抑制作用。

3.2.3 对络氨酸酶活性抑制 测得的吸光度数值根据同上公式计算对酶活性的抑制率，标准物质曲酸（kojic acid）溶液浓度5mM（0.71mg/mL）对胶原蛋白酶抑制活性为76.20%，1.0mg/mL、15.0mg/mL样品溶液对络氨酸酶抑制活性分别为1.88%和21.87%，随着硫酸鼠李糖浓度的增加对络氨酸酶活性抑制作用逐渐增加，说明硫酸鼠李糖对络氨酸酶活性有一定抑制作用。

3.2.4 对弹性蛋白酶活性抑制 测得的吸光度数值根据同上公式计算对酶活性的抑制率，标准物质弹性蛋白溶液浓度0.0054mg/mL对弹性蛋白酶抑制活性为58.60%，1.0mg/mL样品溶液对弹性蛋白酶抑制活性为24.89%，说明硫酸鼠李糖对弹性蛋白酶活性有抑制作用。

4 结论

本文研究从天然绿藻中提取硫酸鼠李糖的方法，并探究RS对各种酶活性的抑制程度，得到如下结论：高温加热酶处理法提取RS最为高效，其得率為24%；RS对各种生物酶的活性抑制实验表明，RS对透明质酸酶和弹性蛋白酶的活性抑制能力较强，对胶原蛋白酶活性无抑制作用，对络氨酸酶活性有一定抑制作用。证明绿藻中提取的RS对于人体的保湿性能、抗黑色素生成性能以及维持肌肤弹性方面均有作用，这为其今后在护肤品行业和健康保健食品方面的发展提供了理论基础。

参考文献

[1]刘晓蕙，张翼伸.海带中褐藻糖胶的分级纯华与结构研究[J].生物化学与生物物理学报，1992，24（4）：297-302.

[2]Sugawara I，Ishizaka S，Moller G.Carrageenans，highly sulfated polysaccharides and macrophage-toxic agents：newly found human T-lymphocyte mitogens[J].Immunobiology，1982（163）：527.

[3]Nakashima H，Kido Y，Kobayashi N，etal.Antiretroviral activity in a marine red alga reverse transcriptase inhibition by an aqueous extract of Schizymeniapacifica.[J].Cancer Res Clin Oncol，1987（113）：413.

[4]Sugawara I，Ishizaka S，Desulfatedcarrageenans and cyto-toxicity of human monocytes[J].Agents and Actions，1983（13）：345.

[5]王艳梅，李智恩，徐祖红.孔石莼化学组分和药用活性研究进展[J].海洋科学，2000，24（3）：25-28. （责编：王慧晴）