人用狂犬病疫苗冻干保护剂筛选研究

刘莹

（宁波荣安生物药业有限公司，浙江宁波 315800）

狂犬病是一类由病毒导致的病症，引发狂犬病的病毒被称为狂犬病病毒，具有致死率高、潜伏期长两大显著特点。事实上，狂犬病也并非想象中的那样恐怖，通过有效措施和手段完全可以得到预防，预防狂犬病可以从以下三方面着手：（1）一旦被犬类咬伤后，应立即清洗伤口，为伤口消毒；（2）提前按规定在相关医疗机构接种狂犬病疫苗；（3）被犬类咬伤后，在不知其是否为病犬的情况下均到相关医疗机构注射抗狂犬病病毒血清或狂犬病免疫球蛋白[1-2]。

目前，市面上在售的预防狂犬病类的疫苗品种繁多，但剂型主要集中在液体制剂和冻干制剂两种剂型，其中狂犬病疫苗冻干粉针剂型具有液体制剂所无可比拟的优势，值得大力推广，其优势主要集中在运输和储存两个方面。低温真空冷冻干燥技术作为一项广泛应用的制药工程技术，其包括冷冻、升华、干燥等一系列复杂的工序，在整个工艺流程中各个参数必须被精准、完美地控制好才能制造出符合质量标准的合格疫苗[3-4]。但是，在步骤繁多的冻干工艺过程中，各种极端的低温、冻结、干燥条件都会一定程度的破坏疫苗制品中的蛋白质；因此，为了保证冻干疫苗制品的良好品质需要在冻干工艺中加入一定的冻干保护剂；此外，本文所介绍的狂犬病疫苗表面具有刺突状糖蛋白，该刺突状糖蛋白极易脱落；在冻干工艺中添加合适的冻干保护剂可以防止其脱落，保证冻干狂犬病疫苗的稳定性及免疫原性[5-6]。

以上介绍了冻干狂犬病疫苗冻干工艺中冻干保护剂的重要性，但选择合适的冻干保护剂更是需要讨论和重视的问题，其在很大程度上决定了可冻干狂犬病疫苗的成品品质。经查阅大量相关冻干疫苗生产冻干保护剂工艺类文献和收集大量相关配方、专利，并经过多次小试研究，最终确定了以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇、明胶为冻干狂犬病疫苗保护剂主成分的保护剂配方，本实验对此配方中的主要影响因素，葡萄糖、右旋糖酐、明胶不同含量组合的保护效果进行比较，筛选最适配方。

1 材料与方法

1.1 疫苗原液

疫苗原液自行制备，狂犬病疫苗应用Vero细胞培养制备。

1.2 主要试剂

葡萄糖（厂商：Sigma，规格：100 g/瓶）、右旋糖酐（厂商：Sigma，规格：10 g/瓶）、乳糖（厂商：上海沃凯试剂有限公司，规格：10 g/瓶）、山梨醇（厂商：上海沪试试剂有限公司，规格：25 g/瓶）、明胶（厂商：上海沪试试剂有限公司，规格：500 g/瓶）。

1.3 供试液制备

以葡萄糖、右旋糖酐、乳糖、山梨醇和明胶为冻干狂犬病疫苗保护剂主成分的固定保护剂配方，改变葡萄糖、右旋糖酐、明胶的含量，制定6种保护剂配方，供试液为此6种保护剂配方分别与原液以1∶1的比例混合均匀，具体保护剂配方如下：（1）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1%明胶；（2）4.5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和1.2%明胶；（3）3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明胶；（4）5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明胶；（5）4.5%葡萄糖、3.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2.5%明胶；（6）5%葡萄糖、3%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇和2%明胶。

1.4 半成品的分装冻干及成品检测

将配制的6批半成品分装至西林瓶中，0.5 mL/瓶，以同一冻干曲线进行冻干。对冻干后的成品进行外观检测，外观合格的成品检测其效力和热稳定性，并检测其对应的半成品的效力，计算效力下降比率；同时根据2015版《中国药典》第三部的要求对成品进行pH值、水分、Vero细胞DNA残留量、牛血清白蛋白含量、细菌内毒素、异常毒性及无菌检测，依据各项检测结果确定最佳的冻干保护剂配方。

1.5 冻干保护剂的适用性验证

应用筛选的最佳冻干保护剂配方制备6批半成品，并进行冻干制备成品，按规定进行检测。

1.6 冻干保护剂的长期稳定性验证

对以上6批成品进行长期稳定性考察，考察调节为4 ℃冷藏，0月、6月、12月为考察时间节点，取样按规定进行相关项目检测。

2 结果与分析

2.1 成品的检测结果

2.1.1 外观

仅从外观来看，6批成品中有3批不合格、3批合格；3批不合格成品（批号4、5、6）的外观主要呈现冻干块萎缩、凹陷成窝、裂痕明显等；3批合格成品（批号1、2、3）的外观主要呈现为冻干块白色疏松有序，通过进一步复溶试验，结果显示复溶速度快，溶液澄清透明，无杂质。

2.1.2 效力试验及相关检测项目

对比3批合格成品（批号1、2、3）冻干前后效力下降水平，批号1冻干前后效力下降约16.3%，批号2冻干前后效力下降约19.3%，批号3冻干前后效力下降约50%。进一步对批号1、批号2进行热稳定试验，批号3由于冻干后效力下降过大已被排除。随后对批号1、批号2进行标准中规定的检测项检测各项指标均合格。

2.1.3 冻干保护剂的筛选

批号1和批号2变量冻干保护剂配方分别为葡萄糖5%、右旋糖酐3%、明胶1%和葡萄糖4.5%、右旋糖酐3%、明胶1.2%；批号1和批号2成品所有检测项均合格，基于生产配样效率考虑，选择配方1为最佳保护剂配方（3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明胶）。

2.2 冻干保护剂的适用性

以最佳冻干保护剂配方配制6批半成品冻干过程效价平均下降6.9%，热稳定效力下降14.8%，无论是冻干后还是热稳定性试验后的效力均大于2.5 IU/剂，其他检测指标均合要求。

2.3 冻干保护剂的长期稳定性

6批成品的效价在12个月内无大幅下降，效价较稳定，均大于2.5I U/剂，其他检测指标均符合要求。

3 结论

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患病。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，其主要起效用的抗原是位于病毒表面包膜上的糖蛋白；该蛋白在形态上内嵌于病毒主体，形成一个个凸起。为了保证狂犬病病毒的稳定性、有效性，狂犬病病毒疫苗最好的成药方式是制成冻干粉针制剂，该剂型是狂犬病疫苗行业发展的必然趋势[7-8]。目前，全球应用得最为广泛的狂犬病疫苗品种均是冻干粉针剂型。

表1 6批成品检测结果

真空低温冷冻干燥特别适合一些对热敏感的物质，疫苗就是一类对热敏感的物质；不仅如此，冻干技术还可以最大程度的保持疫苗的活性和结构[9]。本研究旨在确定最佳的冻干保护剂配方，同时保证疫苗的效力及其他各项检测指标符合标准规定。最终确定了3.5%葡萄糖、2.5%右旋糖酐、30%乳糖、1%山梨醇、2%明胶的最佳冻干保护剂配方。

葡萄糖能够降低冻干过程对病毒包膜的伤害作用，葡萄糖的羟基与蛋白质中的极性基团形成氢键，从而代替蛋白质极性基团周围和磷脂中的水分子，使蛋白质周围形成水化膜，稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干而变性，使疫苗在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持结构与功能的完整性。右旋糖苷在冻干制剂中起到支架作用，使冻干制品外观呈白色疏松体。试验中批号4、5、6配方中右旋糖酐含量较低，在该配方中作为支架的浓度不够，因此冻干后外观不合格。在应用明胶的可降解性时,经常对其进行化学修饰,调控其降解速度以适应不同的需要。明胶于能抑制病毒聚集而使病毒稳定，通过影响水分子的构象加强与蛋白质的疏水作用，抵抗热变性，使蛋白质构象稳定。明胶上的羟基能与病毒蛋白外壳中的羰基或氨基结合，能形成玻璃样结晶颗粒，有效保持病毒外壳的空间构型，从而保持疫苗的活性。

[1]方志正,何建中.应用正交试验研究麻疹疫苗保护剂和冻干条件[J].中国生物制品学杂志,2017,10(2):104-109.

[2]姚亚夫,张卓光,王洪彬,等.提高麻疹乙脑二联活疫苗热稳定性的研究[J].中国生物制品学杂志,2016,11(1):25-28.

[3]Wu R, Deorgescu MM, Delpeyroux F, et al. Thermostabilization of Livevirus Vaccines by Heavy Water( D2O )[J] . V accine,2015,13(12):1058-1063.

[4]Melnick J L. Thermostability of Poliovirus and Measles Vaccines[J].Developments in Biological Standardization,1996,87(87):155.

[5]Sood DK, Aggarwal RK, Sharma SB, et al. Study on the stability of 17D-204 Yellow Fever Vaccine before and after Stabilization[J]. Vaccine,1993,11(11):1124-1128.

[6]耿锟锟,熊非,朱家壁,等.用于药物制剂的冷冻干燥技术及相关影响因素[J].药学进展,2011,35(3):104-109.

[7]国家药典委员会.中国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:107-110.

[8]张敬如,黄复生,王昆.蛋白质药品的真空冷冻干燥技术及研究进展[J].中国药业,2006,15(13):25-27.

[9]孙东坡,胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中保护剂及其保护机理[J].药学进展,2003,27(4):201-205.