样品不同稀释倍数的菌落总数检测分析

高 杰

(国家城市供水水质监测网武汉监测站，湖北 武汉 430000)

饮用水国标GB/T 5750.12-2006定义菌落总数是指水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数[2]。水中的细菌学检查是评判水质优劣的重要指标，作为日常检测七项指标(色度、浊度、嗅和味、肉眼可见物、菌落总数、总大肠菌群、pH值)之一的菌落总数，主要反映了水体的受污染程度以及评价水处理工艺是否达标的主要因素。

在实际工作中检测人员经常会参加微生物盲样考核，能够快速提升自身的技术水平[3]，可以对欠缺的理论知识进行查漏补缺，充分保证测定数据达到确定的检验质量标准[4]。进行菌落总数考核时，检测人员要面临如何确定稀释倍数这一主要问题。本文通过对已知菌落总数的标准样品进行不同梯度的稀释，分析不同稀释倍数样品之间的数据差异，对今后的微生物考核能够提供一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

营养琼脂，标准样品(浓度范围146±19cfu/mL)。

1.2 实验仪器

高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，无菌移液管，无菌取样瓶，9cm玻璃平皿。

1.3 实验步骤

1.3.1 标准样品前处理

将标准样品管从冰箱中取出，置于室温平衡10～15min。将100 mL无菌缓冲液(PBS)倒入100mL无菌取样瓶中定量。把管中有颜色的圆形胶盘无菌操作转移至100 mL无菌PBS中(必要时可使用无菌镊子，一定要在镊子冷却后夹取胶盘)。充分振荡后静置10min，直到圆形胶盘完全溶解，得到待检测标准原液(使用前要充分摇匀)。

1.3.2 平皿计数法

为保证数据的充分可靠性，设计了4个稀释梯度，分别是1倍、2倍、5倍、10倍的稀释液：

1)1倍稀释液是标准原液；无菌操作方法吸取20 mL充分混匀的标准原液，注入盛有20 mL灭菌水的无菌瓶中，混匀成2×稀释液；无菌操作方法吸取20 mL充分混匀的标准原液，注入盛有80 mL灭菌水的无菌瓶中，混匀成5×稀释液；无菌操作方法吸取10 mL充分混匀的标准原液，注入盛有90 mL灭菌水的无菌瓶中，混匀成10×稀释液；

2)以无菌操作方法分别吸取1mL不同稀释倍数的样品，吸取样品前要充分混匀，注入到玻璃平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀；

3)待培养基冷却凝固后，翻转平皿，置于(36±1)℃恒温培养箱内培养48 h，分别进行菌落计数。

2 结果与讨论

2.1 十组平行实验数据

将每一个稀释样品做10组平行样，分析表1和图1的数据发现，1×标准原液和2×稀释样品的菌落总数分布相对集中，平均值也都在合理范围。随着稀释倍数越来越高，样品的菌落总数分布越来越离散，其中5×和10×的稀释样品平均值不在允许浓度范围内。当样品被稀释的倍数变大时，那么每一次取样的均匀性就会越来越低，导致偏差较大。

表1 各稀释样品的菌落总数

图1 各稀释样品菌落总数散点图

2.2 二十组平行实验数据

将每一个稀释样品再做20组平行样，分析表2和图2的数据发现，1×标准原液和2×稀释样品的菌落总数分布情况与图1类似，2×稀释样品的平均值更加接近中位值146cuf/mL。通过增加样品量，5×稀释样品的菌落总数平均值落在合理范围内。但是10×稀释样品的菌落总数依然不在有效范围内，这是因为该标准样品菌落总数的确定范围是(146±19)cfu/mL，如果稀释到10倍，误差就会变大，数据间的差值也会很不均衡。通过增加平行样数量，可以使结果更加精准，但是如果稀释倍数过高，那么就需要更多的样本量，才可能使结果准确，不过这会导致实际实验中效率下降，精力耗费过大。

表2 各稀释样品的菌落总数

图2 各稀释样品菌落总数散点图

2.3 讨论

在实际考核中，一般情况下质控考核作业指导书会标明菌落总数盲样的浓度范围，那么在确定稀释倍数时，检测人员应该尽可能的把稀释后的样品菌落总数落在300cfu/mL范围内，这样可以使菌落在9 cm玻璃平皿上最大化的均匀分布，还能够保证最有效的稀释倍数；如果质控考核作业指导书没有给出菌落总数浓度范围，那么检测人员就要根据实际情况制定一系列的稀释梯度，而且对于稀释度高的样品要做至少20组的平行实验，以此来保证数据的可靠性。不管是否提供浓度范围，实验中都要保证每一个稀释度都有比较充足的样本量，低倍稀释样品可以有所缩减，以此来提高实验效率和准确度。

[1]王虹玲. 微生物质控考核盲样未知菌检测方法探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2000(5): 603.

[2]刘玉红,景二丹,胡兴利, 等. 酶底物法与平皿计数法测定水中菌落总数的比较[J]. 中国给水排水, 2017(2): 111-114.

[3]杨献青,何惠娟. 微生物质控盲样菌株鉴定的检验思路与质量保证[J]. 中国卫生检验杂志, 2010(3): 663-664.

[4]王云国,李怀燕. 食品微生物检验内容及检测技术[J]. 粮油食品科技, 2010(3): 40-43.