基于气相色谱-质谱法的动物类中药材中1-甲基海因分布研究

袁慧雅，高利娜，刘国杰，徐恩宇，刘俊亭

（中国医科大学 1. 法医学院毒物分析教研室；2. 公共基础学院化学教研室，沈阳 110122）

1-甲基海因 （1-methylhydantoin，1-MH） 是五元含氮杂环内源性小分子化合物，化学名1-甲基乙内酰脲。 《中国药典》 2015年版一部蛤蟆油项下将其作为鉴别指标[1]。研究[2-7]表明1-MH作为乙内酰脲类衍生物具有抗炎、消除活氧自由基、止咳平喘等药理活性。有报道[8-9]青环海蛇、蟾蜍油和青蛙油中也检测出1-MH，除蛤蟆油外，林蛙的其他部位也含有1-MH[10]。目前文献[11-12]报道多为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 检测1-MH，为进一步研究具有相似功效动物类中药材与1-MH的关系以及1-MH的生成机制，本研究选取8种不同种属的动物类中药材，在建立气相色谱-质谱法联合测定的基础上研究1-MH的分布状况。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890B-5977A气质联用仪 （美国Aglient公司） ；BT25S分析天平 （德国赛多利斯公司） ；S25涡旋振荡器 （德国IKA公司） ；TG16K-Ⅱ高速离心机 （长沙东旺实验仪器有限公司） 。1-MH （批号20151011） 购自上海一研生物科技有限公司，纯度>99.5%；普罗地芬 （内标，SKF-525A，批号1002181548） 购自美国Sigma公司，纯度>98.0%，其他试剂均为色谱纯。3批次的蛤蚧、蛤蟆油、乌蛇、海蛇、地龙、全蝎、阿胶、紫河车药材均购自北京同仁堂药店，产地为安徽毫州，经中国医科大学刘俊亭教授鉴定为正品。

1.2 溶液制备

（1） 对照品溶液：精密称取 1-MH 对照品适量，加甲醇溶液溶解并制成1.0 mg/mL 溶液。 （2） 内标溶液：精密称取内标物SKF-525A对照品适量，加甲醇溶液溶解并制成100.0 ng/μ L溶液。 （3） 供试品溶液：解剖蛤蚧。分别取其头部、脊椎骨、骨骼肌、四肢、皮肤、尾部适量称重，粉碎至粉末状，各取样0.4 g置于具塞试管中，分别加入内标SKF-525A溶液5 μ L，加入0.01 mol/L盐酸2 mL，超声提取10 min，用2 mL乙酸乙酯震荡提取3 min，3500 r/min离心10 min。吸取有机层，用氮气吹干仪吹至100 μ L，用微量进样器吸取1 μ L进GC-MS分析。乌蛇、海蛇、地龙、全蝎、阿胶、紫河车以及蛤蟆油样品均按上述步骤处理。

1.3 气相色谱-质谱条件

（1） 气相色谱条件：采用HP-5ms （30 m×0.25 mm，0.25 μ m） 弹性石英毛细管柱。采用程序升温：初始柱温为60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至260℃，保持15 min，总计运行26 min。进样口温度为265℃，不分流进样1 μ L。载气为高纯氦气 （99.9%） ，流速为1.0 mL/min。 （2） 质谱条件：采用电子离子轰击源 （EI源，70 eV） ，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，SIM扫描方式，溶剂延迟3 min。

2 结果

2.1 1-MH的图谱认证

气相色谱-质谱法分析以选择离子监测质荷比m/z114色谱图中1-MH的峰面积和质荷比m/z86色谱图中SKF-525A的峰面积进行计算，1-MH保留时间为6.9 min，质荷比m/z114为分子离子峰，质荷比m/z42为酰胺键断裂后的碎片离子峰。均得到了良好的色谱响应，见图1。

图1 1-MH的总离子流色谱图和质谱图Fig.1 The chromatogram and mass spectrum of 1-MH

2.2 线性范围与检出限考察

精密吸取对照品储备液适量，并用甲醇稀释成浓度为0.1、1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μ g/mL的标准工作溶液，各取1 μ L按照“1.3”项下的条件进样分析。以1-MH与内标峰面积之比为纵坐标 （y） ，以1-MH浓度为横坐标 （x） ，绘制标准曲线，得回归方程：y= 9. 392x+ 6.6891 （r = 0.9992） ，在0.1～100.0 μ g/mL浓度范围内线性关系良好。将最低浓度点继续稀释进样，按照3倍信噪比计算，检出限为0.01 μ g/mL。

2.3 方法精密性与重复性考察

取浓度为10.0 μ g/mL的1-MH对照品溶液，连续进样 6 次，每次进样1 μ L，记录1-MH的峰面积，计算相对标准差 （relative standard deviation，RSD） 为1.1%，表明仪器精密度良好。精密称取同一批哈蟆油样品粉末 （约 0.4 g，过3号筛），共6份，分别加入1-MH对照品，制备成质量浓度为10.0 μ g/mL的供试品粉末，按照样品处理方法进样分析后得到1-MH峰面积的RSD为2.03 %。

2.4 方法准确性实验

精密称取同一批蛤蟆油样品粉末 （约 0.4 g，过3号筛），共9份，分别加入1-MH对照品，制备成质量浓度为1.0、10.0、100.0 μ g/mL的供试品粉末，每一质量浓度制备3份，按“1.2”项下方法处理样品，根据测得量和加入量 （1.0、10.0、100.0 μ g/mL） 1-MH计算3个浓度的平均加样回收率分别为95.33%、98.42%、96.70%，RSD分别为0.6%、0.8%和 1.4%。

2.5 蛤蚧各组织中1-MH分布

根据蛤蚧解剖特点，各个组织部位相对分明，故分为5个部位分别测定，结果显示，蛤蚧各部位均检测出1-MH成分，和骨骼肌相关的组织含量均>1 μ g/g，而不含或较少含骨骼肌的组织<1 μ g/g。蛤蚧尾部1-MH含量超过身体其他部位10倍左右，见表1。

表1 蛤蚧各部位组织中1-MH的含量 （n = 3）Tab.1 Content of 1-MH in gecko tissues （n = 3）

2.6 动物类中药材1-MH分布

结果显示，蛤蟆油、乌蛇、海蛇和蛤蚧中检测1-MH分别为4.45、2.84、10.43、10.73 μ g/g，而地龙、全蝎、阿胶和紫河车样品中未检出1-MH。

3 讨论

抗炎作用、免疫调节、抗氧化和平喘作用是蛤蟆油、乌蛇、海蛇、蛤蚧共有的药理作用[13-16]，这几种药材均检出了1-MH，与已有实验研究[2-7]的1-MH抗炎、消除活氧和自由基、止咳平喘等药理活性相符合，推测1-MH可能为这几种中药材共同的药效作用物质之一。

蛤蚧尾部1-MH含量高于蛤蚧身体其他部位，这与传统中医注重使用蛤蚧尾部相吻合。《雷公炮炙论》中记载“凡使蛤蚧，毒在眼，勿伤尾也”[17]。《岭表录异》中有文“力在尾，不具者无功”[18]。现代中药药理研究[19]表明无尾蛤蚧与尾全蛤蚧相比功效有所下降，价格也差别很大。

1-MH化学结构与苯妥英类似，在不同pH条件下存在烯醇互变现象，碱性条件下主要以极性较大的内酰亚胺形式存在，不利于有机溶剂提取。且碱性条件下酰胺键易发生水解开环降低提取率，故本实验采用强酸性条件（pH=2）提取，效果良好。

本实验建立了气相色谱-质谱联用方法，能够准确测定动物类中药材中1-MH含量，操作简便，方法检出限、回收率、精密性等技术指标均符合要求。1-MH是多种中药材的共有成分，推测其可能为蛤蚧、乌蛇、海蛇和蛤蟆油的共同药理活性物质之一。本研究探索动物类中药材药理作用物质基础，对国家中药材质量标准化建立具有一定意义，同时为进一步研究动物体内1-MH的生成机制提供参考。

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