小鼠颌骨发育过程中DMP1基因相关lncRNA的表达研究

夏昕 阮毅 陈绛媛 孔祥波 伍虹

【摘要】 目的   研究C57小鼠不同发育时期颌骨中DMP1基因附近长链非编码RNA（lncRNA）的表达变化情况。 方法   利用lncRNA测序技术和实时定量PCR（RT?PCR）检测孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下颌骨组织样本中DMP1基因位置附近的lncRNA表达变化，分析其与DMP1基因表达变化的关系。 结果   E18D组与2W组间有6 617条差异表达的lncRNA（∣log2 （2W/E18D）∣>1且控制错误发现率<0.01），其中有5条lncRNA在DMP1基因上游或下游300 000 bp以内。RT?PCR分析显示，2W组中DMP1和lnc19450的表达较E18D组降低，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表达较E18D组上升（P均<0.05）。结论   lnc19450的表达与DMP1基因的表达趋势一致，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表达与DMP1基因的表达趋势相反，推测lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表达调控起着重要的作用。

【关键词】  长链非编码核糖核酸;牙本质基质蛋白1基因;小鼠颌骨发育

【Abstract】 Objective   To analyze the changes in the expression of long non?coding RNA （1ncRNA） adjacent to the DMP1 gene in different developmental stages of jawbone in C57 mice. Methods   The lncRNA sequencing and quantitative real?time PCR （RT?PCR） were performed to detect the expression profile of DMP1 gene?related lncRNAs at the embryonic day 18 （E18D） and 2 weeks after birth （2W） in the jawbone of C57 mice，and analyze the relationship between lncRNA expression and the changes in the expression of DMP1. Results   Compared with the E18D group，6 617 lncRNAs were differentially expressed in the 2W group （∣log2 （2W/E18D）∣>1 and FDR<0.01），among which，5 lncRNAs were at the upstream or downstream of DMP1 gene position within 300 kb. RT?PCRdemonstrated that the expression levels of DMP1 and lnc19450 in the 2W group were lower than those in the E18D group，whereas the expression levels of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 were higher compared with those in the E18D group （all P<0.05）. Conclusions   The expression trends of lnc19450 and DMP1 are consistent，whereas the expression patterns of lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 are opposite with that of DMP1 gene，suggesting that lnc19450，lnc30219，lnc8292，lnc30219 and lnc32865 may play a vital role in regulating the expression of DMP1 gene.

【Key words】 Long non?coding RNA;DMP1 gene;Mouse jawbone development

长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，不编码蛋白，在生物体重要生命活动中发挥着极广泛的调控作用[1?3]。lncRNA 的功能多样，最重要的作用是参与基因表达的调节。目前研究表明，lncRNA可以在启动子区通过顺式作用元件（启动子或增强子）或反式作用因子（各种DNA结合因子）调控相关基因的表达[4?5]。牙本质基质蛋白1（DMP1）是骨和牙本质特异性蛋白，在牙和颌骨的分化、成熟过程以及正确调节骨和牙本质的矿化中具有复杂而重要的作用[6?7]。DMP1基因的正常表达是骨和牙齿正常发育、钙化、干细胞向骨和牙本质分化以及正常的矿物质代谢的基础[8?9]。因此，研究DMP1基因表达调控的变化具有重要意义。本研究利用lncRNA测序技术和实时定量PCR（RT?PCR）检测孕18 d（E18D）及出生后2周（2W）的C57小鼠下颌骨组织样本中DMP1基因位置附近的lncRNA的表达变化，并分析它们与DMP1基因表达的趋势。

材料与方法

一、实验动物

孕18 d以及出生后2周的C57小鼠，体质量10～15 g，购自中山大学动物实验中心，饲养于中山大学（大学城）实验动物中心，饲养环境为室温20～22℃、12 h光照?黑暗循环，动物可自由取食及饮水。本研究的所有操作均遵守中山大学动物实验伦理规定。

二、主要试剂及仪器

Trizol提取液和RT?PCR试剂盒均购自日本Takara公司;引物由上海生工合成;Nanodrop2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司;RT?PCR仪（ABI Stepone Plus）购自美国Applied Biosystems公司;lncRNA?seq高通量基因测序仪（Illumina HiSeqTM2000）购自美国Illumina公司。

三、方 法

1. 取 材

取2只日龄为14 d的雄性C57小鼠与6只日龄为16 d的雌性C57小鼠分别合笼（雄∶雌=1∶3），次日通过观察雌鼠阴道栓情况确定是否受孕，受孕小鼠定义为孕1 d，以此精确记录怀孕时间获得E18D C57小鼠。对E18D（3只）以及2W（4只）小鼠逐只称重，按体质量0.01 ml/g腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠，麻醉后的小鼠固定于干冰解剖台上，于显微镜下解剖分离完整下颌骨组织，液氮速冻，保存于?80 ℃冰箱。取材完成后，采用颈部脱臼法处死小鼠，按实验动物死亡处理方式处理，麻醉及后续处理方法参考文献[10]。

2. 总RNA抽提

取适量（50～100 mg）小鼠下颌骨组织样本，用研钵在液氮环境下研磨，按照试剂盒说明书步骤，分别抽提E18D及2W小鼠的下颌骨组织总RNA。对提取得到的RNA通过Nanodrop2000测定光密度值以及琼脂糖凝胶电泳检测完整性，检测合格后，其中一部分送基迪奥生物进行lncRNA?Seq高通量基因测序分析，剩余部分用于后续的RT?PCR验证分析。

3. lncRNA测序数据分析

采用Illumina HiSeqTM 2000进行测序，对下机数据去除掉质量不合格的碱基序列及核糖体RNA，将得到的非编码序列与Ensemble基因组数据库进行比对。测序结果的统计分析基于泊松分布模型，根据lncRNA的表达量（RPKM值）计算该lncRNA在E18D组和2W组中的差异表达倍数[log2 （2W/E18D）]，对差异检验的P值作多重假设检验校正，通过控制错误发现率（FDR）决定P值的域值，其中∣log2 （2W/E18D）∣>1且FDR<0.01的lncRNA为差异表达的lncRNA。

4. RT?PCR

对E18D组和2W组样本中的DMP1基因以及在DMP1基因附近（300 000 bp以内）差异表达的lncRNA进行RT?PCR分析。取2 μg总RNA按照逆转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit步骤完成逆转录，取2 μl逆转录产物使用SYBR Green qPCR SuperMix反应体系，在ABI Stepone Plus系统上进行RT?PCR扩增，引物序列见表1。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40 个循环。 PCR产物的特异性根据熔解曲线判定，融解曲线分析温度60 ～ 95 ℃。基因的相对表达量采用2?ΔΔCt法分析，内参基因为GAPDH，E18D组的目标基因表达设置为1。每个样品均平行做3个复孔。

四、统计学处理

使用SPSS 22.0进行统计分析。E18D组与2W组的基因相对表达量以x±s表示，组间比较采用t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

结果

一、E18D组和2W组中差异表达lncRNA的分析

通过lncRNA测序技术在E18D组和2W组中共鉴定到38 566条lncRNA，其中6 617条在E18D组和2W组样本中差异表达，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720条，RPKME18D

二、DMP1基因附近差异表达lncRNA的分析

对6 617条小鼠颌骨不同发育时期差异表达的lncRNA在基因组的位置以及其相对DMP1基因（5号染色体，104202613?104214102，Ensemble数据库编号为ENSMOSG00000029370）的距离进行分析，在DMP1基因附近获得5条差异表达的lncRNA，见表2。其中lnc30219和lnc17290在DMP1基因的上游，而lnc19450、lnc8282和lnc32865在DMP1基因的下游，lnc19450距离DMP1基因最近，为16 505 bp。

三、E18D组和2W组中DMP1及其基因附近5条lncRNA的RT?PCR分析

DMP1基因在2W组相对表达水平低于E18D组（P<0.05）。E18D与2W组间差异表达且位于DMP1基因附近的5条lncRNA中，lnc19450在2W组中相对E18D组的表达水平下降，lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865在2W组中相对E18D组的表达水平上升（P均<0.05），其中lnc32865相对表达水平最高，见图1、表3。

讨论

lncRNA在生物体重要生命活动中发挥极广泛的调控作用[9]。大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，具有明显的时空表达特异性、组织或细胞特异性[11]。目前对于在颌骨发育过程中起着重要作用的lncRNA未见报道，为了筛选出在小鼠颌骨不同发育时期差异表达的lncRNA，我们采用E18D和2W的C57小鼠下颌骨组织为研究材料，利用Illumina HiSeqTM2000平台的lncRNA测序技术在E18D组和2W组样本中，共检测出38 566条lncRNA。通过差异表达倍数（2倍及以上）和多重假设检验校正（FDR<0.01）分析，共获得6 617条在E18D组和2W组样本中差异表达的lncRNA，其中RPKME18D>RPKM2W共3 720条，RPKME18D

lncRNA 可以通过多种方式调节基因的转录，如通过表观遗传修饰途径包括组蛋白修饰（乙酰化、甲基化等）方式或DNA甲基化等调控基因的表达水平[12?13]。lncRNA 也可以作用于启动子、转录因子，抑制下游蛋白质基因的表达;抑制目的基因转录，转录干扰等在基因转录水平进行调控[14?16]。DMP1在牙和颌骨的分化、成熟过程以及正确调节骨和牙本质的矿化中具有复杂而重要的作用，骨细胞中DMP1基因表达的时空特异性可能受非编码区的顺式调节区调控[17]。lncRNA具有时空表达特异性，并可以通过顺式作用元件调节机制调控目的基因的表达。为了筛选出可能通过顺式作用元件调节机制参与调控DMP1基因表达的lncRNA，本研究对6 617条lncRNA在基因组的位置以及其相对DMP1基因的距离进行初步分析，在距离DMP1基因300 000 bp以内区域获得5条差异表达lncRNA，分别为lnc19450、lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc?32865，其中lnc19450距离DMP1基因最近。为了对lncRNA测序的结果进行验证，本研究采用RT?PCR对DMP1基因以及5条lncRNA在E18D组和2W组样本中的表达水平进行分析。在2W组中，DMP1基因的表达水平相比E18D组降低，这一结果也与已经发表的文献报道一致[18?20]。E18D组与2W组中5条lncRNA的表达水平比较差异均有统计学意义，与lncRNA测序结果一致。lnc19450的表达与DMP1基因的表达趋势一致，而lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865的表达在2W组中上升，与DMP1基因的表达趋势相反，其中lnc32865相对表达水平最高。由此推测，lnc19450、 lnc30219、lnc8292、lnc30219和lnc32865可能在DMP1基因的表达调控中起着重要的作用，其中距离DMP1基因较近的lnc19450和相对表达水平较高的lnc32865可能与DMP1的关系较为密切。上述研究结果为进一步阐明lncRNA调控DMP1基因表达的分子机制提供了基础，在后续实验中，我们将运用过表达或小干扰RNA沉默技术，阐明相应lncRNA在过表达或抑制后DMP1的表达情况，探讨lncRNA19450或lncRNA32865对DMP1的mRNA表达的调控作用以及成骨细胞矿化作用的影响，再通过RNA结合蛋白免疫沉淀、凝胶迁移实验和启动子双荧光素实验等分析手段，揭示lncRNA19450或lncRNA32865是否通过结合DMP1基因的启动子区形成组蛋白修饰复合物的分子机制调控DMP1基因的表达，从而明确其在颌骨发育过程中的作用及相关作用机制。

参 考 文 献

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（收稿日期：2018?10?22）

（本文编辑：林燕薇）