利用CODEHOP设计简并引物并克隆玫瑰LAZY1基因片段

李政宏 ，李 勇 ，邹 凯，李忠健 ，赵兰勇*，徐宗大 *

（1.山东农业大学 林学院，山东 泰安 271000；2.肥城市园林绿化管理局，山东 肥城 271600）

玫瑰是重要观赏花木，不仅被广泛用于城乡绿化中，而且是食品工业和香料工业的重要原料[1]。近年来，国内外学者对玫瑰的研究主要集中在花色、育种、品种分类和花期调控等方面，对玫瑰株型研究甚少。株型是园林植物的重要观赏性状[2]。植物的株型主要与地上部分枝角度有关，研究结果表明植物分枝和众多因素有关，包括分子调控机制、重力响应以及光周期等[3]。随着基因组学研究的进一步发展，调控植物分枝角度的IGT基因家族被发现，该家族包含 LAZY1、TAC1、DRO1 等基因[4-7]。 其中 LAZY1 沉默可以造成植物侧枝水平生长，削弱重力反应，在玉米LAZY1突变体的研究中，突变体的根部向地性生长仍然正常，但地上部分却完全匍匐生长，这说明LAZY1基因主要参与植物地上部分的分枝调节[8]。

以往设计简并引物的方法都建立在大量生物信息收集的基础上，通过比对同源性较高的氨基酸序列，找到它们共同的保守区域，再由它们的保守区域进行引物设计[9]。传统方法需要花费大量时间去比对序列，不仅消耗很多的时间精力而且设计出来的引物往往都有着较高的简并度。本研究通过CODEHOP在线程序设计简并引物，以玫瑰幼茎cDNA作模板，经过RT-PCR克隆得到玫瑰LAZY1基因片段，为后续玫瑰LAZY1基因扩增和研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玫瑰匍匐品种‘平枝玫’，种植在山东农业大学南校区玫瑰种质资源圃。

1.2 方法

1.2.1 取材

2017年4 月中旬，植株长出嫩枝时，将其剪下,放入液氮，在-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 总RNA提取

参照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒说明书，完成玫瑰幼茎总RNA的提取。

1.2.3 反转录合成cDNA第一链

参照abm公司5XAll-In-OneRTMasterMix试剂盒的使用说明书，合成cDNA，包括基因组DNA的去除。反转录得到的 cDNA放于-20℃保存。

1.2.4 引物设计与合成

根据在水稻、玉米、杨树、桃树等植物中已有的关于LAZY1基因的序列信息，使用Genebank数据库找到五条以上LAZY1同源基因，短柄草（XM_010239413.2）、高粱（XM_002449467.2）、谷子（XM_004979233.2）、胡杨（XM_011022498.1）、毛果杨（XM_002299287.2）、木薯（XM_021774420.1）、水稻（XM_015761205.1）、桃树（XM_007223027.2）、玉米 （NM_001138862.1）。将以上序列保存为FASTA格式，提交到blockmaker，对序列保守区进行同源查找后，得到10个保守区。将10个保守区提交到CODEHOP服务器进行简并引物设计，各项引物设计参数为：简并度（degeneracy）64，Tm 值 60℃，遗传密码“Standard”，密码子选用框选择和玫瑰同属蔷薇科的苹果（malus domestica）。参数选择完毕点击“Look for primers”,在新界面选择分数高的引物序列，将所选序列提交上海生物工程公司合成。

1.2.5 PCR扩增

PCR扩增LAZY1基因片段，以玫瑰幼茎RNA反转录得到的cDNA为模板，用设计好的简并引物进行RT-PCR扩增。本实验采用降落PCR（touchdown PCR）程序[10-13]：94℃预变性 5min，之后进入扩增程序，94℃变性30s，62℃—50℃每降一度循环 2次，49℃循环 20次，72℃延伸 1min，共 44个循环，最后72℃延伸8min。扩增完后用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。

1.2.6 产物回收、测序

用Takara DNA回收试剂盒回收扩增产物片段，与pMD18-T Vector连接后转入大肠杆菌Trans-T1培养，之后进行菌液PCR验证，验证完成后将菌液送交华大基因测序。

1.2.7 PCR产物结果分析测序结果通过NCBI的数据库进行Blast检索，对产物片段进行序列比对和同源性分析。

2 结果与分析

2.1 简并引物设计

从CODEHOP程序设计得到多对引物中，筛选出6条上游引物和4条下游引物 （表1）。再通过oligo分析，根据退火温度相差小，简并度小，所得产物片段不要太小的原则，从中选出上游引物UP1、UP3、UP6，下游引物 DW2、DW4 进行配对，组成引物组合表（表2）

2.2 RT-PCR电泳结果

由表2的引物组合进行RT-PCR，经过琼脂糖电泳检测后，结果B组和D组引物未扩增出条带，A、C和E组引物扩增结果中不止一条带，说明引物对特异性不强，F对引物扩增出一条带，说明F对引

表1 引物筛选结果

表2 引物组合表

物特异性较好（图1）。

图1 PCR扩增结果

2.3 PCR产物回收和序列分析

根据凝胶电泳结果，实验选取F组引物克隆片段进行回收，经过载体克隆测序后，得到长度为410bp的片段，将其命名为F片段。测序后的片段在Genbank中通过Blast进行比对（表3），其中 Blastn结果表明F片段与欧洲甜樱桃 （Prunus avium）的LAZY1基因序列同源性为85%，得分为490，E value为2e-134，这说明F片段和欧洲甜樱桃的LAZY1基因序列同源性较高。Blastx的结果显示F片段编码氨基酸与葡萄 （Vitis vinifera）LAZY1基因编码氨基酸的同源性为64%，得分为156分；和Herrania umbratica中LAZY1基因编码氨基酸的同源性为61%，比对得分为143分；和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）中LAZY1基因编码氨基酸的同源性为68%，比对得分为132分；和麻风树（Jatropha curcas）中LAZY1基因编码的氨基酸同源性为66%，比对得分为127分。通过Blast的结果，可以说明克隆片段为玫瑰LAZY1基因片段。

3 讨论

为了获取未知核酸序列，需要进行大量生物信息的收集。张磊和马月林在克隆目的基因时，根据和研究材料亲缘关系近的物种同源基因直接设计引物，这种方法只能针对那些已有转录组或者基因组数据的近缘物种[3,14]。当研究对象没有基因组或转录组数据时，这种方法就不可行了。这时需要通过设计简并引物，对研究对象进行同源克隆得到目的基因。

传统的简并引物设计建立在大量生物信息的收集上。首先大范围搜索已知目的基因编码的氨基酸序列，通过比对不同物种的氨基酸序列确定氨基酸保守区域，保守区域长度不能低于6个氨基酸残基长，再根据保守区域设计简并引物。使用这种方法设计的简并引物简并度往往偏大，并且简并引物的特异性也不高，PCR出现非特异性扩增的可能性很大。同时由于密码子的简并性，设计出来的简并引物退火温度（Tm值）容易偏低，造成PCR假阳性反应，给后续研究增大人力和物力投入[15-18]。

相比于传统简并引物设计方法，利用CODEHOP设计简并引物具有特异性高及灵敏性强等优点。CODEHOP方法的原理是把简并引物设计为两个部分，第一部分是3’简并核心区，先比对多个同源序列得到共同的氨基酸保守区域，再从氨基酸保守区域中选取既连续又保守的3~4个氨基酸序列进行引物设计，因为是从连续保守序列开始设计的引物，所以可以保证引物设计的成功率高；另一部分为5’非简并夹板区，这一部分是由保守氨基酸对密码子的偏爱性原则预测所得到的最佳碱基组成。在设计简并引物的过程中，可以通过调整3’简并核心区的长度来达到降低简并碱基使用量的目的。依靠5’非简并夹板区的保守性，可以使3’简并核心区在扩增过程中与模板结合的更稳定，并且5’非简并夹板区也可以在不增加简并度的同时提高引物的Tm值，这些都可以提高PCR产物扩增的特异性。当然，在扩增开始时，5’非简并夹板区可能会和模板发生错配，但3’核心区与模板的不适配会终止引物对与模板的配对，经过连续多轮扩增后引物的特异性匹配会大量增加，最终提高扩增的特异性和准确性。对于克隆未知基因片段是一种高效而使用的方法。

表3 F片段Blast结果

本研究利用CODEHOP在线设计简并引物，配合降落PCR（Touchdown PCR）技术，成功克隆出玫瑰LAZY1基因片段，为后续玫瑰LAZY1基因全长的克隆奠定基础，也为IGT基因家族中各基因的起源和演化提供参考。

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