烟草赤星病菌对嘧菌酯及其添加水杨肟酸后的敏感性检测

张彬彬，赵晓雨，张凯伦，徐后娟，夏晓明

山东农业大学，植物保护学院，山东 泰安 271000

烟草赤星病（Alternɑriɑ ɑlternɑtɑ(Fries)Keissler）是烟草生长中、后期发生的一种重要的真菌性叶斑类病害，在世界各烟草产区均有发生[1-2]。该病潜伏期短、发病快，在外部条件适宜时，短时间内便可造成大面积流行，给烟叶生产带来巨大经济损失[3]。化学防治是该病主要防治措施，由于杀菌剂的长期使用，烟草赤星病菌的抗药性问题越来越严重[4]。多项研究表明，烟草赤星病菌已对菌核净、甲基硫菌灵和腐霉利等表现出不同程度的抗性[5-7]。

嘧菌酯（azoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（QoIs类）的典型代表[8]。主要作用于细胞色素b的Qo中心，阻断电子从细胞色素b转移到细胞色素c1，阻止ATP的产生，干扰真菌线粒体呼吸，从而抑制真菌生长或杀死真菌[9-11]。由于其作用位点单一，杀菌剂抗性委员会（FRAC）将其归为高抗性风险农药[12]。随着嘧菌酯的推广应用，出现了多例田间病原菌对嘧菌酯产生抗性的报道。黄瓜霜霉病菌[13]、番茄叶霉病菌[14]和果树灰霉病菌[15]均已对嘧菌酯产生了不同程度的抗性。

真菌体内存在旁路氧化途径，当真菌的正常呼吸被QoIs类杀菌剂抑制后，能够诱导启动旁路氧化途径获取能量，从而导致病原真菌对QoIs类杀菌剂敏感性降低或不敏感[16-17]。水杨肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）是旁路氧化酶的专一性抑制剂，可抑制旁路氧化酶活性从而使旁路氧化途径无法正常进行。在使用QoIs类杀菌剂过程中，水杨肟酸可能会增强QoIs类杀菌剂对病原真菌的抑菌效果[18]。在离体条件下，添加一定浓度的水杨肟酸能够显著提高多种植物病原真菌对QoIs类杀菌剂的敏感性[19-20]。但不同病原菌对添加水杨肟酸后的敏感性存在明显差异[21-23]，且同一病原菌不同菌株对添加水杨肟酸后的敏感性差异也较大[24]。已有研究表明添加水杨肟酸能提高嘧菌酯对烟草赤星病菌的毒力[25-26]，但这些研究所采用的菌株数量相对较少，供试菌株均来自于贵州地区，不同烟草赤星病菌对添加水杨肟酸后的敏感性是否存在差异尚不明确。本研究拟采用菌丝生长速率法，检测从山东和湖北烟区采集的33株烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性，研究添加水杨肟酸对烟草赤星病菌对嘧菌酯敏感性的影响，以期为不同烟区应用嘧菌酯防治烟草赤星病提供参考。

1 材料与方法

1.1 病原菌采集和培养

供试的山东烟草赤星病菌菌株分离自2016年采集于青岛、潍坊、临沂和日照等烟区的发病烟叶。参照方中达[27]的组织分离法在实验室进行赤星病菌的分离和纯化。病菌单孢纯化后置于4 ℃ 条件下保存备用。湖北菌株由山东省烟草病虫害研究中心提供。

1.2 供试药剂

用万分之一电子天平分别准确称取95%嘧菌酯（山东潍坊润丰化工股份有限公司）和99%水杨肟酸（上海麦克林生化科技有限公司）各1.0526 g和1.0101 g，分别溶于丙酮和甲醇中，配成10000 mg·L-1的母液，备用。

1.3 试验方法

1.3.1 药液配制

在预试验的基础上，将嘧菌酯按有效成分含量分别设定 5、10、20、40、80、160、320 mg·L-17 个系列质量浓度处理。用含有0.1%吐温80的水溶液将嘧菌酯母液分别稀释至上述设计浓度的10倍浓度（即50、100、200、400、800、1600和3200 mg·L-1），备用。

1.3.2 含药PDA培养基的制备

在超净工作台中，将预先融化、灭菌的90 mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基加入已灭菌锥形瓶中，冷却至45 ℃，然后用移液枪分别加入1.3.1中配好的各处理药液10 mL，充分摇匀后等量倒入直径为9 cm的培养皿中，制备成相应浓度的含药PDA平板。以不含药剂的0.1%的吐温80水溶液处理作空白对照。

1.3.3 烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性测定

采用菌丝生长速率法测定烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性。先将烟草赤星病菌在PDA培养基上活化7 d，然后在超净工作台内，用内径为7.0 mm的灭菌打孔器从菌落边缘打取菌饼，并用接种器将菌饼接种于1.3.2中制备好的含药平板中央，菌丝面朝下，盖上皿盖，放入28℃恒温培养箱内黑暗培养。每处理4个重复。连续培养7 d 后，用直尺采用十字交叉法垂直测量各处理菌落直径各1次，求其平均值，减去7.0 mm菌饼直径，即为菌落增长直径。测量每个重复试验结果，然后求出每个处理浓度的菌落增长直径平均值，并计算每个处理对病原菌的菌丝增长抑制率。

菌丝增长抑制率（%）=[（对照菌落生长直径-处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径]×100

1.3.4 水杨肟酸协同下烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性测定

参照上述方法在PDA培养基上采用菌丝生长速率法测定加入水杨肟酸的烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性。根据预备试验结果选定水杨肟酸的协同作用浓度为100 mg·L-1。然后参照1.3.1和1.3.2描述的方法配制含100 mg·L-1水杨肟酸的嘧菌酯系列浓度的PDA平板。水杨肟酸协同嘧菌酯的最终试验浓度（有效成分含量）为 5、10、20、40、80、160 和 320 mg·L-1。然后按照1.3.3描述的方法测定水杨肟酸协同下烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性。

1.4 数据处理

采用SPSS 16.0统计分析软件，以药剂浓度对数值为横坐标，菌丝增长抑制率几率值为纵坐标，进行回归分析，求出杀菌剂对病原菌的EC50、相关系数、回归方程以及95%置信限。

2 结果与分析

2.1 烟草赤星病菌对嘧菌酯敏感性测定

采用菌丝生长速率法测定了33株烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性，结果表明（表1，表3），嘧菌酯对供试烟草赤星病菌毒力的EC50值介于60.5230～111.7918 mg·L-1， EC50平 均 值 为 83.9068±2.4339 mg·L-1。 其中，山东沂南菌株YN-02对嘧菌酯最敏感（EC50为60.5230 mg·L-1），山东诸城菌株ZC-01敏感性最低（EC50为 111.7918 mg·L-1），两者相差 0.85倍。嘧菌酯对山东菌株毒力的EC50值介于60.5230～111.7918 mg·L-1，平均为 82.7986±2.5515 mg·L-1；对湖北菌株毒力的 EC50值介于 61.5468～110.6608 mg·L-1，平均为88.0230±6.6785 mg·L-1。

2.2 水杨肟酸协同作用下烟草赤星病菌对嘧菌酯敏感性测定

采用菌丝生长速率法测定了水杨肟酸协同作用下33株烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性，结果（表2，表3）表明，在100 mg/L 水杨肟酸协同作用下，嘧菌酯对33株烟草赤星病菌菌丝生长的毒力均显著增强。EC50值介于 19.9090～35.6684 mg·L-1，平均为29.2007±0.7801 mg·L-1，与不添加水杨肟酸相比，毒力提高了0.70～2.98倍，平均提高了1.87倍。其中对山东沂水的YS-07菌株的增效作用最明显，毒力提高了2.98倍，对山东沂南的YN-02菌株的增效作用最低，毒力提高了0.70倍。

在100 mg/L水杨肟酸协同作用下，嘧菌酯对山东省烟草赤星病菌的EC50值介于19.9090～35.6684 mg·L-1，平均为 28.5494±0.8914 mg·L-1，毒力平均提高了1.90倍；对湖北省烟草赤星病菌的EC50值介于26.2377～35.2025 mg·L-1，平均为 31.6197±1.3290 mg·L-1，毒力平均提高了1.78倍。

表1 烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性Tab.1 The sensitivities of Alternɑriɑ ɑlternɑtɑ to azoxystrobin

表3 烟草赤星病菌对嘧菌酯及其添加水杨肟酸后的敏感性比较Tab.3 The sensitivity of Alternɑriɑ ɑlternɑtɑ to azoxystrobin in the presence or absence of SHAM

3 讨论与结论

黄艳飞等研究表明[26]，嘧菌酯对烟草赤星病菌具有较好的室内活性，嘧菌酯抑制病原菌菌丝生长的EC50值为25.8300 mg·L-1。但随后研究又发现，嘧菌酯抑制4株烟草赤星病菌菌丝生长的EC50值介于129.6～278.2 mg·L-1， 平 均 为 203.95 mg·L-1[25]。 雷 飞斌[7]研究发现，嘧菌酯抑制2株烟草赤星病菌菌丝生长的EC50值分别为88.178和172.912 mg·L-1。本研究在离体条件下，采用菌丝生长速率法，检测了采自山东和湖北两省的33株烟草赤星病菌对嘧菌酯的敏感性。结果表明，嘧菌酯对供试烟草赤星病菌 的 EC50值 介 于 60.5230～111.7918 mg·L-1，EC50平均值为83.9068±2.4339 mg·L-1， 嘧菌酯对烟草赤星病菌具有一定的菌丝生长抑制活性。与前人研究结果相比，供试33株烟草赤星病菌对嘧菌酯相对较为敏感。

水杨肟酸能够通过抑制病原菌的旁路氧化途径而增强QoIs类杀菌剂对部分病原真菌的抑菌效果，但对部分病原真菌的增加效果不明显[22-23]。研究表明，烟草赤星病菌中同样存在线粒体电子传递的旁路氧化途径，加入旁路氧化途径专性抑制剂水杨肟酸，能显著增强嘧菌酯对烟草赤星病菌的毒力[25-26]。本研究发现，加入100 mg·L-1水杨肟酸后，嘧菌酯对33株烟草赤星病菌菌丝生长的毒力均显著增强，EC50值介于19.9090～35.6684 mg·L-1，毒力提高了 0.70～2.98 倍，平均提高了1.87倍，表现明显的增效作用，但不同菌株对嘧菌酯加入水杨肟酸的敏感性差异较大。韩路等[24]发现，加入100 mg·L-1水杨肟酸后，在供试的91个水稻稻瘟病菌中，有78.02%的菌株对嘧菌酯的敏感性增强，但只有31.87%的菌株增效倍数大于1.5倍，表现明显增效效果，这种差异可能与不同菌株的旁路氧化酶活性有关[24]。

事实上，嘧菌酯对烟草赤星病菌的孢子萌发和菌丝生长均有抑制活性，但对孢子萌发的抑制活性要高于菌丝生长[25-26,28]。因此，田间施用嘧菌酯对烟草赤星病可能同时表现出保护和治疗活性，且可能保护作用要优于治疗作用[26]。在离体条件下，由于培养基平板上没有抑制病原菌旁路呼吸代谢途径的物质，减弱了嘧菌酯对烟草赤星病菌菌丝生长的活性[25]。而在植物体内存在抑制旁路氧化酶（AOX）的（类）黄酮类物质，因此嘧菌酯在植物体上的实际活性要高于室内活性，并具有优良的防治效果[28]。

本研究结果表明，可以将水杨肟酸与嘧菌酯结合应用于田间烟草赤星病的防治。但本研究结果均是采用菌丝生长速率法获得的结果，后续仍需采用孢子萌发法进行全面验证，并通过离体叶片试验和田间试验证明嘧菌酯对烟草赤星病的治疗和保护作用。此外，将嘧菌酯和水杨肟酸结合应用于烟草赤星病的田间防治技术，有待于进一步研究。

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