花生蛋白磷酸酶2C家族基因的鉴定和盐胁迫响应分析

陈冠旭，秦贵龙，李恩广，赵春梅，乔利仙，2，王晶珊，2，隋炯明，2

(1.青岛农业大学 生命科学学院，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学 农学院，山东省旱作技术重点实验室，山东 青岛 266109)

PP2C(PP2C-type protein phosphatase)是一类单体丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶[1-2]，其活性依赖于Mg2+或Mn2+等二价阳离子，并且严格受其调节。进化分析表明，PP2C蛋白在进化过程中相对保守[3]，它广泛存在于低等生物和高等生物中，而且在植物中PP2C基因的数量最多[4]。目前，在拟南芥、玉米、水稻等植物中都筛选出了大量PP2C基因[5]。Liu等[6]报道了一个拟南芥基因AtPP2CG1，该基因编码的蛋白属于PP2C家族的G亚族，能够调控拟南芥对盐胁迫的响应，且其调控依赖于ABA。Schweighofer等[7]报道了拟南芥中76个PP2C基因，并将它们分成10个组。Xue等[8]利用生物信息学手段从水稻和拟南芥基因组中分别分离出78，80个PP2C基因，并分别将它们分为11，13个组。拟南芥中，A亚族的9个成员中包含6个负调控ABA信号的蛋白：ABI1、ABI2、AHG1、AHG3/AtPP2CA、HAB1和HAB2[9]。在胡杨中也证实了A亚族的PeHAB1基因是ABA信号途径中的调控基因[10-11]。在苜蓿中发现了一种受逆境胁迫诱导的属于B亚族的PP2C(MP2C)蛋白，是MAPK途径中的负调控因子[12]。C亚族的PP2C基因与花的器官发育有关[13]；而关于PP2C基因其他亚族的研究并不多。

Bhalothia等[14]在拟南芥和烟草中研究发现，PP2C通过催化可逆磷酸化，反作用于特定的蛋白激酶，下游信号负调控ABA信号通路，可以加速植物的发育以及增强植物对逆境胁迫的耐受性。但是到目前为止，油料作物中有关PP2C基因的研究很少，更未见它们在花生中功能研究的报道。

前期试验中，以花生的胚小叶作为外植体，使用平阳霉素作为诱变剂进行离体诱变，然后用羟脯氨酸作为筛选压对愈伤组织定向筛选，获得了一批羟脯氨酸耐性苗及其后代[15]，其中1个突变体(S2)在0.7% NaCl溶液中发芽率超过50%，且具有较高的SOD和POD值，而对照花育20(S4)在相同浓度的NaCl溶液中发芽率只有6.7%。本研究以测序完成的转录组和表达谱为基础[16]，利用生物信息学研究手段，在整个转录组水平上筛选PP2C家族成员，进行了PP2C基因的染色体定位和分类；利用在盐胁迫处理前后测序获得的多个时间段的表达谱，鉴定盐胁迫响应相关的PP2C基因，并进行分子进化分析，寻找氨基酸的保守功能域和启动子区域的保守顺式调控元件。本研究将为探讨花生PP2C基因的耐盐功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

利用平阳霉素(Pingyangmycin)作为化学诱变剂，对花生品种花育20(S4)进行离体诱变，使用羟脯氨酸(Hydroxyproline，HYP) 作为筛选压，在MSB5有机培养基中进行定向筛选，从后代中鉴定出1个在0.7% NaCl处理下发芽率显著高于诱变亲本，且可稳定遗传的耐盐突变体(S2)。

1.2 试验方法

1.2.1 转录组数据库构建 沙培法将耐盐突变体S2和对照S4的种子培养至幼苗期(约21～28 d)，用250 mmol/L NaCl溶液处理幼苗，在分别处理0，6，12，24，48 h后取叶片，每个样品包含2个生物学重复。将样品混合后，送交测序公司进行双向测序，构建转录组文库，处理数据后在NCBI数据库注册(注册号SRR3114511)。用PFAM、NR、KEGG、KOG、SwissProt、GO、NT等数据库进行基因功能注释。

1.2.2 盐胁迫处理前后表达谱数据库构建 采用Solexa技术对盐胁迫处理前后的20个样品进行数字化表达谱测序，构建花生叶片盐胁迫处理前后的表达谱数据库，并以上述转录组数据库为参考，对整理后的表达谱数据库Unigene序列进行分析，并在NCBI数据库注册(注册号SRR3210665和SRR3210666)。

1.2.3PP2C基因家族成员鉴定、基因结构分析和染色体定位 根据上述7大数据库所得到的基因功能注释结果，搜索PP2C基因。将其与花生全基因组数据(http：//www.peanutbase.org)中的A组野生种基因组序列进行比对，下载同源性最高的序列。将同源序列翻译成蛋白后，利用DNAMAN分析花生PP2C各个成员的蛋白分子量和理论等电点等信息。根据基因在A组野生种基因组序列和转录组序列比对结果，使用在线工具(Gene Structure Display Server 2.0)进行基因结构分析，得到其外显子-内含子结构图。根据与花生全基因组数据库比对后基因位置的结果，进行染色体定位，得到各个基因在染色体上的分布结果。

1.2.4 系统进化树的构建和同源比对分析 通过Clustal X软件对拟南芥和花生PP2C蛋白进行多重序列比对分析，然后用软件MEGA 6.0 生成PP2C基因的系统进化树。

1.2.5 盐胁迫响应分析 利用盐胁迫处理前后S2和S4的20个数字表达文库谱，分析PP2C基因在胁迫处理前后的任何2个时间段的表达量，如果调整后的P值< 0.05，则认为该基因对盐胁迫有响应。

1.2.6PP2C基因启动子顺式调控元件分析 选取受盐胁迫诱导表达的PP2C基因，利用Plantcare软件分析其启动子的顺式调控元件。

2 结果与分析

2.1 花生叶片转录组数据库的构建及PP2C家族基因的筛选

根据上述7大数据库的基因功能预测，搜索PP2C基因，最终筛选出79个具有完整开放阅读框的PP2C基因(图1)。

图1 79个PP2C基因在花生A基因组染色体上的位置Fig.1 The location of the 79 PP2C genes on the chromosomes of A genome from peanut

这79个PP2C基因共分布于花生A组野生种10条染色体上。其中，数量最多的，有15个成员分布在第9号染色体；其次为第1号和8号染色体，分别有11，12个PP2C基因，而第2号染色体上只有1个PP2C基因(图1)。花生PP2C蛋白大小在不同成员间差别很大，为78～1 398个残基，其等电点为4.14～10.21。基因结构分析显示，外显子个数2～23个 (图2)。

2.2 花生PP2C基因的聚类和同源比对分析

拟南芥中的PP2C基因可分为A～L 13个亚族，16个亚类。将筛选到的79个花生PP2C基因，与拟南芥的PP2C基因进行了多重序列比对和系统进化分析，结果表明，花生的绝大多数PP2C基因聚到除B亚族外的12个亚族，可分为15个亚类(图3)。

2.3 盐胁迫处理前后花生叶片表达谱数据库的构建及PP2C基因的盐胁迫响应分析

利用盐胁迫处理前后S2和S4材料的20个数字表达文库谱，对79个PP2C基因在盐胁迫处理前后的任何2个时间段的表达量进行差异分析，根据调整后的P值，共筛选出35个PP2C基因受盐胁迫诱导表达(图4、表1)，涉及12个亚族14个亚类，其中A亚族b亚类、G亚族b亚类、I亚族、L亚族所有成员均受盐胁迫诱导表达，而G亚族a亚类的所有成员均不受盐胁迫诱导表达。

进一步分析发现，35个PP2C基因中，7个基因(c38994_g1、c32376_g1、c9698_g1、c43142_g1、c34581_g2、c34200_g1和c24765_g1)只在S2中受盐胁迫诱导表达；7个基因(c25744_g1、c42931_g1、c38232_g1、c34126_g1、c32418_g1、c32619_g2和c37903_g2)只在S4中受盐胁迫诱导表达，其余21个基因在S2和S4中均受盐胁迫诱导表达。

在S2中，与胁迫处理前相比，6 h出现差异表达的基因数目最多，有23个，其中8个上调，15个下调；在48 h只有1个基因出现差异表达。而在S4中，与胁迫处理前相比，12 h出现差异表达的基因数目最多，共有18个差异基因，其中11个下调，7个上调；24 h出现差异表达的基因数目最少，只有3个(图5)。

图2 79个花生PP2C基因的结构示意图Fig.2 The structure diagram of 79 PP2C genes in peanut

图3 花生与拟南芥PP2C基因的聚类分析Fig.3 The clustering analysis of PP2C genes in peanut and Arabidopsis

图4 盐胁迫处理前后35个PP2C基因的表达情况Fig.4 Expression of 35 PP2C genes before and after salt stress treatment

亚族Subgroups亚类Subclasses受盐胁迫诱导基因数The number of genes responsive to salinity stress基因代号Gene ID受盐胁迫诱导基因数/总基因数The number of genes responsive to salinity stress/The number ofPP2C genesAa2c38232_g1、c42931_g12/4b2c36899_g1、c40455_g22/2B00/0C2c39126_g2、c41528_g12/10D5c34581_g2、c34581_g1、c38994_g1、c39003_g1、c25744_g15/11Ea3c30618_g1、c45163_g1、c25828_g13/7b3c35944_g1、c32418_g1、c32619_g23/4F12c43117_g1、c24765_g12/4F21c37903_g21/2Ga00/2b3c34126_g1、c43142_g1、c36599_g13/3H3c35011_g1、c33691_g1、c56870_g13/6I3c24443_g1、c37777_g2、c24598_g13/3J1c44239_g11/2K3c39153_g2、c9698_g1、c41013_g13/7L2c41121_g1、c43819_g12/2

S2.耐盐突变体；S4.HY20 CK；例如：S2_6vsS2_0表示S2中处理6 h后与处理0 h表达量显著差异的基因的数目，黑色代表上调，数目为8个；白色代表下调，数目为15个；依次类推。S2.Salt tolerant mutant；S4.HY20 CK；For example：S2_6vsS2_0 indicates the number of genes that are significantly different in expression of treatment 6 hours and 0 hours in S2，with black representing up-regulation，the number of which is 8，white representing down-regulation，the number of which is 15；and so on.

2.4 PP2C基因启动子顺式调控元件分析

选取这35个受盐胁迫诱导表达的PP2C基因，利用Plantcare等软件分析其启动子的顺式调控元件。研究发现分别有91%，80%，83%和80%的PP2C基因启动子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE这些胁迫响应元件(图6)。

图6 35个花生PP2C基因启动子顺式调控元件分析Fig.6 Analysis of cis-regulatory elements of the promoters of 35 PP2C genes in peanut

3 结论与讨论

PP2C是一类具有多种功能的蛋白磷酸酶。目前，已经有许多文章在不同的模式生物中对PP2C的多个成员进行了特性分析以及鉴定。例如，MP2C是一个从苜蓿cDNA文库中筛选到的参与MAPK信号级联通路的PP2C类基因，直接作用于MAPK信号途径中通过酵母双杂交鉴定出的SIMK(Stress induced MAPK)，MP2C通过对SIMK中pTEpY序列的苏氨酸残基去磷酸化使SIMK信号途径失活[17-18]。研究表明，植物受到创伤后叶片中的MP2C大量表达，而SIMK途径随着MP2C的表达而逐渐失活，说明MP2C是SIMK途径的负调控因子[19-20]。玉米ZmPP2C基因在盐和干旱胁迫反应中作为一个负调控因子[21]。另有一些相关试验验证了PP2Cs基因在其他模式植物中的ABA信号转导途径起着负调控的作用，表明PP2Cs在信号转导途径中具有相对保守的功能[22]。实时荧光定量PCR分析表明，小麦TaPP2C59基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此，可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答[23]。胁迫处理刚毛柽柳后，ThPP2C基因在刚毛柽柳根和叶中的表达均发生了明显改变，但时空表达模式不完全相同。表明ThPP2C基因可能参与了刚毛柽柳高盐、干旱以及激素处理的适应过程，但其功能还有待进一步验证[24]。

为了分析花生中PP2C基因家族的情况，利用构建的花生叶片转录组数据库，通过生物信息学手段，在整个转录组水平上筛选蛋白磷酸酶2C家族成员，鉴定出了79个具有完整开放阅读框PP2C基因，位于花生A组野生种的10条染色体上。将筛选到的79个花生PP2C基因，与拟南芥的PP2C基因进行了多重序列比对和系统进化分析，发现花生的PP2C基因聚到除B外的12个亚族15个亚类中，还有一些没有聚到任何亚族中，它们可能属于一些新的亚族。利用盐胁迫处理前后S2和S4的20个数字表达文库谱，筛选到35个PP2C基因受盐胁迫诱导表达。进一步研究发现绝大多PP2C基因启动子含有HSE、MBS、TC-rich repeats和ARE这些胁迫响应元件。该研究为后续通过反向遗传手段研究花生中PP2C的功能以及利用提供了理论基础。

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