基于miR-1285在卵巢癌组织中的表达及对癌细胞增殖和凋亡的影响

李 娜，熊 姣，王东红

(遵义医学院附属医院妇科，贵州遵义 563003)

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是一种小分子非编码RNA，由20～25个核苷酸组成[1]。miRNAs最早于1993年在真核生物中被发现，后续的研究表明其能通过碱基互补配对与目的基因mRNA的5′端或3′端相结合，介导目的基因mRNA的降解或者抑制其与转录因子的结合而降低目的基因mRNA的翻译过程，miRNAs通过其基因调控的功能，广泛参与真核生物细胞内多种生物过程，包括细胞信号的传导、细胞增殖与分化、细胞周期的调控等，同时也与多种肿瘤的发生、发展过程密切相关，因此对于miRNAs在生物体生长发育及癌症中的研究已成为生命科学领域研究的重点[2-5]。早期已有研究表明，miRNA-1285(miR-1285)在组织中的异常表达可能和多种类型的肿瘤发生密切相关，如胰腺癌、肝癌等[3-5]。为探讨miR-1285的表达水平在卵巢癌发生、发展过程中的作用，笔者利用荧光定量PCR的方法检测miR-1285在卵巢癌组织和癌旁组织中的表达，分析其与癌症发生的关系；同时运用体外细胞培养实验，观察miR-1285在人源的卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3)增殖和凋亡过程中的作用，为探讨其在卵巢癌发生、发展过程中的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 选取40例2014年9月至2015年9月来本院妇科就诊的卵巢癌患者组织切片标本，包括卵巢癌组织切片及对应癌旁组织切片，癌组织是指取自患者卵巢癌组织区域的细胞，癌旁组织是指在患者卵巢癌组织周围未发生坏死或癌变的正常卵巢组织细胞。本研究经本院伦理委员会审核批准，参与此次研究的所有患者均签署知情同意书，且均在术前3个月未接受任何关于抗癌治疗的药物或其他相关性治疗的手段。

1.1.2细胞株及试剂 两株人源的卵巢癌细胞株(SKOV3、OVCAR3)购自中科院上海细胞库；RPMI-1640细胞培养基(货号：SH30809)、DMEM培养基(货号：SH30033)、胎牛血清(FBS，货号：SH30084)、0.25%的胰酶消化液(货号SH30042)及10×磷酸盐缓冲液(PBS，货号：SH30256))均购自美国Hycolone公司；TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription试剂盒(货号：4366596)、TaqMan®Universal PCR Master Mix(货号：4324018)均购自美国ABI公司；Lipofectamine®2000 Transfection Reagent(货号：11668027)购自美国Invitrogen公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(货号：556547)购自美国BD公司；噻唑蓝(MTT，货号：M2128)购自美国Sigma 公司；TRIzol试剂(货号：15596-026)购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染 (1)细胞复苏：首先取出冻存的两株人源卵巢癌细胞(SKOV3、OVCAR3)，迅速放置于37 ℃水浴锅中融化，然后四度低速(300 r/min)离心3 min，弃去上清液，加入1 mL含有10% FBS的RPMI-1640培养液将细胞重悬，然后置于培养皿中，放入含有5% CO2的37 ℃培养箱进行培养，当生长至合适的细胞密度(70%～80%)时，对其进行传代培养。(2)细胞转染：其中miR-1285 mimics及mimics control均在生工生物进行合成(表1)，细胞转染严格按照美国Invitrogen公司的Lipofectamine®2000 Transfection Reagent说明书进行操作。

1.2.2卵巢癌细胞系全RNA的抽提 对转染48 h后的卵巢癌细胞经0.25%胰酶消化，收集消化后的细胞悬液于15 mL离心管中；进行4 ℃低速(1 000 r/min)离心2 min，弃去上清液，置于冰上；加入1 mL Trizol裂解液，重悬并混匀细胞，置于冰上；向Trizol裂解液中加入200 μL氯仿，剧烈震荡细胞悬液，室温放置5～10 min，然后采用四度，12 000 r/min离心15 min；取离心之后的上层水相，于RNase-free的1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，充分震荡混匀后，于冰上放置30～40 min；取出离心管，然后再四度，12 000 r/min离心15 min，得到RNA沉淀；采用500 μL 75%乙醇对RNA沉淀进行两次洗涤，然后风干；加入50 μL RNase-free的水，室温溶解RNA；采用NanoDrop对总抽提的RNA进行浓度测定，置于-20 ℃备用。

表1 miR-1285 mimics与mimics control的序列信息

1.2.3RNA的反转录及荧光定量PCR 按照美国ABI公司的TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription试剂盒操作说明书，对抽提的RNA进行体外反转录实验，得到Cdna产物；反应条件为：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 min，4 ℃保存。以得到的cDNA为模版，进行荧光定量PCR，采用TaqMan®Universal PCR Master Mix 20 μL反应体系，在罗氏LightCycler480仪器上操作，以U6作为表达检测的内参，ΔCT表示miR-1285的相对表达，其中ΔCT=|CTmiR-1285-CTU6|；反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s进行40个循环的扩增。

1.2.4癌细胞增殖活力的MTT检测 首先对消化后的卵巢癌细胞进行血小板计数，然后将转染miR-1285 mimics及mimics control的细胞接种到96孔培养板上，其中每孔接种约5×103个细胞；在含5%CO2的37 ℃培养箱进行一段时间的培养后(分别是0、24、48、72 h)，加入20 μL 5 mg/L MTT，放入培养箱继续培养4 h；取出96孔培养板，将每孔中的液体吸出并加入120 μL二甲基亚砜进行溶解；混合均匀后，通过酶标仪检测其在570 nm处的吸光值(A570)，以反映细胞增殖能力的强弱。

1.2.5癌细胞凋亡率的检测 将转染miR-1285 mimics及mimics control 24 h后的人源卵巢癌细胞取出，更换其培养液为不含FBS的无血清培养液，并将培养皿置于37 ℃，含低浓度CO2(1% CO2)的环境中，将卵巢癌细胞继续培养至48 h；然后通过100 μL 0.25%胰酶对贴壁的细胞进行消化，收集细胞于1.5 mL离心管中，并在避光环境中依次加入5 μL Annexin V、5 μL PI，充分混匀后，在避光环境中室温孵育20 min，然后对细胞进行流式细胞仪分选检测。

2 结 果

2.1卵巢癌组织中miR-1285的表达水平 以癌细胞的U6作为内对照，对卵巢癌组织及对应癌旁组织中miR-1285的相对表达水平进行定量分析发现，相较于癌旁组织(5.41±1.25)，卵巢癌组织细胞中miR-1285 表达水平(2.73±1.04)较低，差异有统计学意义(t=10.42，P<0.05)。

2.2转染miR-1285 mimics后人卵巢癌细胞的增殖活性 根据转染人源卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3的情况不同，依次分为转染组(转染miR-1285 mimics)、阴性对照组(转染mimic control)和空白对照组(未转染任何microRNA)。在转染后的4个时间段(0、24、48、72 h)，每个时间点取15份平行设置的细胞样品进行观察，对细胞采用MTT法检测其A570值。结果表明，在SKOV3细胞系中，转染组的A570值在24 h之后明显低于阴性对照组与空白对照组(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组在4个时间点处的A570值比较,差异无统计意义(P>0.05)，见表2；在OVCAR3细胞系中，转染组的细胞其A570值在48 h之后明显低于阴性对照组与空白对照组(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组在4个时间点处的A570值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 SKOV3细胞系在各个时间点处的A570值(n=15,±s)

*:P<0.05，与转染组比较

表3 OVCAR3细胞系在各个时间点处的A570值变化(n=15,±s)

*:P<0.05，与转染组比较

图2 OVCAR3细胞系流式分选结果

2.3转染miR-1285 mimics后促进人卵巢癌细胞凋亡 对转染miR-1285 mimics 48 h后的细胞进行流式细胞分选发现(图1)，SKOV3细胞系的凋亡率升高，明显高于转染mimic control的阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而阴性对照组的细胞凋亡率与空白对照组无明显差异(P>0.05)，见表4。在OVCAR3细胞系中(图2)，转染miR-1285 mimics 48 h后，细胞的凋亡率也升高，明显高于转染mimic control的阴性对照组细胞，差异有统计学意义(P<0.05)，而阴性对照组的细胞凋亡率则与空白对照组无明显差异(P>0.05)，见表4。

表4 细胞凋亡率的比较(n=15,±s，%)

*:P<0.05，与转染组比较

3 讨 论

卵巢癌在女性生殖系统中发病率较高，属于常见恶性肿瘤，约占女性生殖系肿瘤的三分之一，其发病十分隐匿，对患者的早期诊断造成了较大的困难，临床上被诊断为卵巢癌的患者70%以上已发生了盆腔等多处组织的转移，导致其5年生存率低于30%[6]。临床上关于卵巢癌的发病病因还不是十分清楚，其病理也较为复杂，缺少有效的治疗手段，目前还未有明确的临床指标可对卵巢癌的诊断及治疗提供参考[7]。因此，对卵巢癌发病机制的研究显得尤为关键。miRNAs是一类存在于细胞内，长度约为22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，自从20世纪90年代LEE等[5]在真核生物中发现了第一个miRNA(Lin4)之后，学者们对miRNAs进行了一系列的后续研究，发现miRNAs通过碱基互补配对，与其靶基因结合，可调控基因的表达，从而参与细胞的增殖和分化[8]。在对癌症细胞的研究中发现，miRNAs在癌症的发生、发展中起着十分重要的作用，其通过调控靶基因的表达，参与细胞内信号通路的传导，参与细胞周期的调控，介导细胞的凋亡过程等[9]。有研究报道，通过利用miRNA芯片技术，分别检测人源卵巢癌细胞系及正常卵巢上皮细胞中miRNAs的表达谱发现，一共检查到173个miRNAs的表达，其中在两种细胞系中共同表达的miRNAs共160个，有35个miRNAs表达差异有统计学意义(P<0.05)，其中表达下调的miRNAs有31个，表达上调的miRNAs有4个，在这4个下调的miRNAs中，包含两个具有抑制肿瘤发展的miRNAs，分别是let-7d与miRNA-127，暗示着miRNAs与卵巢癌的发生有一定的相关性[10]。有学者对106例卵巢癌患者进行分期，即早期组卵巢癌和晚期组卵巢癌患者，采用基因芯片技术检测卵巢癌组织中miRNAs的表达，发现两组存在44个miRNAs基因的表达差异，且在晚期卵巢癌患者中表达均下调，包括具有肿瘤抑制功能的miR34a及miR15a等，表明在卵巢癌的发展过程中miRNAs起着重要的作用[11]。

本研究发现，miR-1285与卵巢癌的发生十分相关，其在卵巢癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织；除此之外，细胞学实验证明，miR-1285的表达升高，会致使癌细胞的增殖能力明显下降，同时导致癌细胞的凋亡率明显升高，表明miR-1285与卵巢癌的发生、发展过程密切相关，miR-1285可能作为卵巢癌细胞中的抑癌因子，在癌细胞的凋亡过程中发挥功能。分析其发挥功能的可能机制：有研究发现在胰腺癌中miR-1285与相关蛋白结合，以miRNA诱导沉默复合体(miRISC)蛋白复合体的形式与靶基因YAP1的mRNA相结合，在转录水平抑制其翻译过程，从而达到抑癌的作用[12]；另有研究报道，miR-34c与miR34b通过调控靶基因P53的转录，导致卵巢癌的发生[13]；miR214则通过负调控第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源物基因(PTEN)的表达，参与蛋白激酶B(AKT)通路，从而在卵巢癌的转移过程中起作用[14]；miR-210通过对靶基因组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控，参与肿瘤转移时血管的生成[15]。

综上所述，miRNAs通过调控不同的靶基因参与卵巢癌的发生、发展过程。本文通过对40例卵巢癌患者的研究发现，miR-1285与卵巢癌的发生、卵巢癌细胞的增殖及凋亡密切相关，表明其在卵巢癌发生、发展中起着重要作用，但是至于该过程中的具体分子机制，还有待进一步的探索。本研究为了解miR-1285与卵巢癌发生的关系奠定了一定的理论基础和实验依据。

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