雷帕霉素诱导Ana-1细胞自噬杀伤黑素化马尔尼菲青霉

胡素侠，姚剑波，张荣波，杨立新

(1.安徽省淮南市第一人民医院检验科 232007；2.江苏省盐城师范学院海洋与生物工程学院 224005；3.安徽理工大学医学院免疫与检验教研室，安徽淮南 232001；4.安徽省淮南市第一人民医院耳鼻喉科 232007)

马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)是一种双相性机会致病真菌，在环境温度中以菌丝相生长并通过分生孢子扩散，而在侵袭人或动物时的体温条件下可呈酵母相存在于网状内皮-巨噬细胞系统内，通过分泌色素及多种胞外酶抵抗宿主细胞的杀伤作用，长期存在于巨噬细胞内并分裂增殖[1-2]。在艾滋病患者、器官移植及大量使用糖皮质激素等免疫力低下的患者体内，PM可引发散播性感染[3-4]。由于PM对氟康唑等经验性抗真菌药物的治疗敏感度不佳、易于误诊等原因该病的致死率较高[5]。黑素是多种病原真菌共有的毒力因子，通过抵抗巨噬细胞的吞噬功能和活性氧杀伤作用提高致病性，因而黑素化PM侵袭力更强、更易出现散播性感染，给马尔尼菲青霉病的治疗造成更大困难。

细胞自噬作为保守的胞内成分降解机制，通过降解废旧蛋白、衰老细胞器，以及参与固有免疫与适应性免疫维持内环境稳态[6]。近年来已发现巨噬细胞的自噬活化在抵抗白假丝酵母、烟曲霉等常见侵袭性致病真菌中扮演重要角色，然而自噬在PM感染中发挥的作用未见报道[7-8]。笔者前期预实验发现，巨噬细胞吞噬PM后自噬水平升高受限，而黑素化PM显著抑制了巨噬细胞的自噬活化。基于自噬的抗真菌作用，本研究采用小鼠巨噬细胞系Ana-1细胞，探讨通过经典的自噬诱导剂雷帕霉素激活巨噬细胞自噬抵抗黑素化PM的可行性，从而为该病的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 RPMI-1640基础培养基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)细胞消化液购自美国Hyclone公司；兔源抗LC3多克隆抗体、兔抗小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG购自美国Abcam公司；Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG购自美国Invitrogen公司；雷帕霉素购自美国Selleck公司；左旋多巴胺(L-DOPA)、天门冬酰胺购自美国Sigma-Aldrich公司；脑心浸液(BHI)培养基购自美国Difco公司，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)为自行配置。Ana-1细胞系与PM菌株由安徽理工大学医学院免疫与检验教研室保存。

1.2方法

1.2.1黑素化酵母相PM悬液的制备 将冻存的PM以三点法接种于PDA培养基进行复苏，于25 ℃恒温培养箱中培养7 d，再以相同方法转接3次纯化菌种后，接种于BHI培养基斜面中37 ℃培养7 d，传代3次，挑取少量菌种进行乳酸酚棉兰染色，显微镜下观察并计算酵母相细胞比例。酵母相细胞比例达到70 %以上后，在培养PM菌的BHI培养基斜面中加入2 mL含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，轻柔刮落菌落并涡旋5 min，静置10 min后吸取上清液获得悬液。配置含150 mL/L胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，含多巴RPMI-1640完全培养基另加入0.1 g/L L-DOPA、1.0 g/L天门冬酰胺。将部分PM悬液转接入含或不含多巴的完全培养基中，于电热恒温培养箱中37 ℃、200 r/min避光震荡培养10 d，分别获得黑素化或常规酵母相PM悬液。菌液用PBS洗涤3次后以RPMI-1640完全培养基重悬，调节菌液密度为1×107CFU/mL备用[9]。

1.2.2黑素化PM感染Ana-1细胞后LC3Ⅱ蛋白表达水平的检测 以含100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基常规培养Ana-1细胞。当倒置显微镜下观察Ana-1细胞的汇合率为85%时，采用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化细胞，按2×105cells/cm2的密度在6孔细胞培养板中接种5组细胞：雷帕霉素对照组(A组)、白假丝酵母对照组(B组)、黑素化PM组(C组)、常规PM组(D组)和空白对照组(E组)。细胞培养过夜后，B、C、D组分别按感染复数约为8加入相应菌液共孵育3 h，A组以50 nmol/L雷帕霉素孵育48 h，E组加入等体积RPMI-1640完全培养基作为空白对照。孵育结束后以预冷的PBS洗涤细胞，裂解细胞后以GAPDH蛋白作为内参，采用蛋白质免疫印记法(Western blot)检测LC3Ⅱ蛋白表达水平。免疫杂交时使用兔源抗LC3多克隆抗体(1∶1 000)、4 ℃条件下孵育过夜，PBST洗涤3次后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶4 000)，37 ℃孵育1 h，电化学发光(ECL)法显色曝光。上述实验重复3次用于结果分析[10]。

1.2.3雷帕霉素处理黑素化PM感染后Ana-1细胞的自噬水平检测 将Ana-1细胞按2×105cells /cm2的密度在6孔细胞培养板中接种4组细胞：黑素化PM+雷帕霉素组(A组)、黑素化PM组(B组)、雷帕霉素组(C组)、空白对照组(D组)。Ana-1细胞培养过夜至贴壁后，A、C组加入雷帕霉素至50 nmol/L，细胞培养箱中孵育48 h，继而于A、B组中按感染复数约为8分别加入黑素化PM悬液共孵育3 h，D组加入等体积RPMI-1640完全培养基作为空白对照。孵育结束后，按1.2.2中Western blot的实验条件进行Ⅱ型微管相关蛋白1型轻链3(LC3Ⅱ)表达水平的检测，实验重复3次并分析结果。

1.2.4雷帕霉素处理后黑素化PM感染的Ana-1细胞LC3蛋白定位的观察 将Ana-1细胞按1×105cells/cm2的密度在24孔细胞培养板中接种A、B、C、D、E共5组细胞。待Ana-1细胞培养过夜至贴壁后，A组与D组细胞分别加入雷帕霉素至50 nmol/L并于细胞培养箱中孵育48 h，之后于A、B组中按感染复数约为8分别加入黑素化PM悬液，C组细胞按相同感染复数加入常规PM悬液孵育3 h，E组加入等体积RPMI-1640完全培养基作为空白对照。孵育结束后以预冷的PBS洗去未被吞噬的菌体，采用10 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，5 mL/L Triton X-100透膜20 min，正常山羊血清封闭20 min。免疫杂交时以兔源抗LC3多克隆抗体(1∶200)于37 ℃湿盒中孵育1 h，PBST洗涤3次后采用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔 IgG(1∶500) 于37 ℃湿盒中孵育1 h。荧光倒置显微镜观察并采集图像[11]。

1.2.5雷帕霉素对黑素化PM直接杀灭效能的测定 取部分1.2.1中以RPMI-1640完全培养基混悬、菌液密度为1×107CFU/mL的黑素化PM悬液等分为3组。其中两组加入雷帕霉素至50 nmol/L，并于细胞培养箱中分别孵育3、6 h；另一组加入等体积溶剂作为空白对照。之后将4组菌液分别离心、弃上清液，以无菌超纯水重悬并梯度稀释，接种于PDA培养基中37 ℃培养7 d并计数菌落，根据与对照组活菌数相比计算菌存活率。

1.2.6不同时间段雷帕霉素处理对Ana-1细胞杀灭黑素化PM效能影响的测定 Ana-1细胞按2×105cells/cm2的密度在6孔细胞培养板中接种6组细胞，培养过夜后其中3组分别加入50 nmol/L雷帕霉素并孵育48 h，继而在各组中均按感染复数约为8分别加入黑素化PM悬液，37 ℃孵育0、3、6 h时分别取出1组含或不含雷帕霉素的细胞，转移上清液。以无菌超纯水充分裂解Ana-1细胞，将各组细胞裂解物与相应上清液混匀，全部平铺于PDA培养基上37 ℃培养7 d并计数菌落，计算各组Ana-1细胞对黑素化PM的杀菌效率。

1.2.7不同浓度雷帕霉素对Ana-1细胞杀灭黑素化PM效能影响的测定 Ana-1细胞按2×105cells/cm2的密度在6孔细胞培养板中接种5组细胞，培养过夜后其中4组分别加入25、50、100及200 nmol/L雷帕霉素并孵育48 h，继而在各组中均按感染复数约为8分别加入黑素化PM悬液，在37 ℃孵育3 h后分别吸取各组细胞的上清液。以无菌超纯水充分裂解细胞，将各组细胞裂解物与相应上清液混匀，全部平铺于PDA培养基上37 ℃培养7 d并计数菌落，计算各组Ana-1细胞对黑素化PM的杀菌效率。

2 结 果

2.1黑素化PM抑制Ana-1细胞的自噬活化 Western blot结果显示，白假丝酵母与雷帕霉素刺激Ana-1细胞后LC3Ⅱ的表达水平较空白对照组明显升高(均P<0.01)；而在相同感染复数的常规PM刺激下，Ana-1细胞的LC3Ⅱ表达水平较白假丝酵母组明显降低(P=0.018)，并且黑素化PM组的Ana-1细胞LC3Ⅱ表达水平明显低于常规PM组(P=0.005)，见图1。

2.2雷帕霉素处理后黑素化PM感染的Ana-1细胞的自噬水平 无雷帕霉素预处理时Ana-1细胞吞噬黑素化PM后LC3Ⅱ表达水平与空白对照组比较无明显差异(P=0.218)；而在雷帕霉素预处理后，吞噬黑素化PM的Ana-1细胞LC3Ⅱ表达水平明显升高(P=0.009)，并且与雷帕霉素组比较无明显差异(P=0.173)，见图2。

1：雷帕霉素对照组；2：白假丝酵母对照组；3：黑素化PM组；4：常规PM组；5：空白对照组

图1黑素化PM抑制Ana-1细胞LC3Ⅱ蛋白的表达

1：黑素化PM+雷帕霉素组；2：黑素化PM组；3：雷帕霉素组；4：空白对照组

图2雷帕霉素处理后黑素化PM感染的Ana-1细胞LC3Ⅱ表达升高

2.3雷帕霉素引发黑素化PM与LC3蛋白的共定位 免疫荧光实验显示，空白对照组细胞绿色荧光均匀分布于细胞质内，而单纯使用雷帕霉素处理后细胞质内出现大量的较为细小的绿色荧光斑点。吞噬了黑素化PM的Ana-1细胞LC3蛋白在细胞质内的分布较为均匀，而雷帕霉素预处理后自噬体膜标记蛋白LC3聚集为明亮的绿色斑点，显示了自噬体的构建。与此同时，绿色斑点与黑素化PM具有明确的共定位关系，见图3。

2.4雷帕霉素通过诱导巨噬细胞自噬杀伤黑素化PM 在50 nmol/L雷帕霉素、37 ℃共孵育3 h或6 h的条件下，黑素化PM与未经雷帕霉素处理组的菌存活率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图4A。而Ana-1细胞与黑素化PM共孵育3 h (P=0.026)或6 h (P=0.014)后，雷帕霉素处理组的菌存活率较同时段无雷帕霉素处理组明显降低(P<0.05)。与此同时，在与无雷帕霉素的Ana-1细胞共孵育0、3及6 h后，各组间黑素化PM的存活率明显变化(P>0.05)，见图4B。

2.5雷帕霉素诱导巨噬细胞自噬杀伤黑素化PM的剂量依赖性 为观察不同浓度雷帕霉素对Ana-1细胞杀伤在黑素化PM效能的影响，采用25、50、100及200 nmol/L的雷帕霉素预处理Ana-1细胞孵育48 h。通过菌培养与菌落计数后发现，50、100及200 nmol/L雷帕霉素处理组黑素化PM的存活率明显低于空白对照组(P<0.05)，相邻浓度处理组之间黑素化PM的存活率相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，并且黑素化PM的存活率随雷帕霉素浓度升高而降低，见图5。

1：黑素化PM+雷帕霉素；2：黑素化PM组；3：常规PM组；4：雷帕霉素对照组；5：空白对照组；BF示明场，绿色荧光示LC3蛋白，Merge示明场与绿色荧光的组合

图3雷帕霉素引发黑素化PM与LC3蛋白的共定位

A：雷帕霉素对黑素化PM直接抗菌效能的检测；B：有无雷帕霉素预处理的Ana-1细胞对黑素化PM抗菌效能的检测；*：P<0.05，与无雷帕霉素处理组比较

图4雷帕霉素通过诱导Ana-1细胞自噬杀伤黑素化PM

1：空白对照组；2：25 nmol/L雷帕霉素处理组；3：50 nmol/L雷帕霉素处理组；4：100 nmol/L雷帕霉素处理组；5：200 nmol/L雷帕霉素处理组：*：P<0.05，与空白对照组比较；#：P<0.05，与25 nmol/L雷帕霉素处理组比较；△：P<0.05，与50 nmol/L雷帕霉素处理组比较；▽：P<0.05，与100 nmol/L雷帕霉素处理组比较

图5雷帕霉素通过诱导Ana-1细胞自噬杀伤黑素化PM

3 讨 论

近年来对细胞自噬机制愈加深入的研究揭示，自噬在应对多种病原生物的感染中扮演了重要角色，但目前对于自噬在抗真菌感染中机制的认识相对较少。白假丝酵母及克柔假丝酵母在感染巨噬细胞时后者的自噬水平显著升高，而阻断自噬体的构建则使巨噬细胞对二者的杀菌效能明显降低[12-13]。在本研究中，笔者采用白假丝酵母菌作为阳性对照，首先观察了吞噬常规及黑素化PM后巨噬细胞内自噬体标记蛋白LC3Ⅱ的表达水平。结果发现，常规PM对巨噬细胞系Ana-1细胞激活自噬的作用有限。有趣的是，吞噬了黑素化PM的Ana-1细胞自噬水平较空白对照组细胞无明显差异，推测黑素对PM感染应激下的自噬激活具有抑制作用。笔者前期研究发现，烟曲霉感染时还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(NADPH oxidase，NOX)通过产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)活化巨噬细胞自噬，而在PM的感染同样会触发巨噬细胞的呼吸爆发[14]。已知的是，在线粒体衰老泄露、多种病原体感染应激时ROS均可作为引发自噬体构建的上游调节分子[15]。根据黑素对ROS的消除作用，笔者推测PM可以通过分泌黑素干扰宿主细胞的自噬功能，但PM的其他毒力因子是否具有抑制自噬的作用有待进一步明确，后续笔者也将纯化PM产生的黑素并探究黑素能否独立影响巨噬细胞自噬[16-17]。

自噬作为古老的保守机制，多种病原体在与宿主细胞自噬的长久斗争中进化出能逃逸甚至颠覆自噬的防御作用，而通过调节自噬提高杀伤效能成为治疗此类病原体感染的策略之一，据此笔者探究了自噬诱导剂雷帕霉素在治疗PM感染中的价值。值得注意的是，较高浓度的雷帕霉素可直接抑制多种致病真菌。但由于雷帕霉素的免疫抑制作用和毒性，患者难以耐受有效的药物浓度而限制其应用价值。因此，笔者提出采用低浓度雷帕霉素通过激活自噬通路的策略对黑素化PM发挥抗菌效能。接受器官移植、大剂量糖皮质激素治疗等免疫抑制患者是散播性真菌感染的主要好发人群。基于雷帕霉素的以上特性，该药物对以上免疫抑制患者的抗真菌治疗可能具有特殊优势。通过Western blot与免疫荧光实验，笔者发现雷帕霉素能有效提高吞噬黑素化PM的Ana-1细胞自噬水平，并且诱导的自噬体可包绕黑素化PM，为雷帕霉素激活的巨噬细胞自噬可降解黑素化PM提供了直接证据。

继而，笔者测定了雷帕霉素对黑素化PM的抗菌效能。在本研究条件下，雷帕霉素对黑素化PM的生存率无明显影响，并且Ana-1细胞与黑素化PM共孵育3或6 h后菌存活率也无明显变化，表明低浓度雷帕霉素对黑素化PM无直接杀伤作用，并且Ana-1细胞在6 h以内也无抗菌作用。而以雷帕霉素预处理后，与Ana-1细胞共孵育的黑素化PM存活率明显降低，并且与雷帕霉素浓度存在明显的剂量依赖性。

综上所述，黑素化PM可抑制巨噬细胞的自噬活化，而雷帕霉素可通过诱导自噬提高巨噬细胞对该菌的杀菌效能。后续，笔者将通过散播性黑素化PM感染的动物模型，进一步探究雷帕霉素在黑素化PM感染的治疗价值与病理机制。

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