胃癌中Cx43与P-Ezrin表达的意义及相关性研究*

张立伟，张爱东，谭淑娟，卢思英，李春辉

(1.承德护理职业学院护理系,河北承德 067000；2.承德医学院附属医院病理科,河北承德 067000)

胃癌在世界范围内发病率和病死率均较高，间隙连接蛋白43(Cx43)作为间隙连接通道的组成部分，在Cx家族中起关键作用，其表达水平的异常与肿瘤的发生发展关系密切。然而Cx43对肿瘤组织基因转录及表达水平的下调机制尚未完全明确，成为目前研究的热点。细胞骨架连接蛋白(Ezrin)连接着细胞膜分子与肌动蛋白丝，且发挥重要作用的是细胞的生长过程中磷酸化的Ezrin(P-Ezrin)，其异常表达可能导致细胞出现生物行为的异常，从而参与肿瘤的发生过程。目前，联合研究Cx43与P-Ezrin在胃癌中的表达及相关性的研究尚未见报道。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年2月至2016年10月期间承德医学院附属医院经病理证实的胃癌手术标本110例，同时选取40例距肿瘤5 cm以上的正常胃组织作对照组，患者在术前均未接受抗癌治疗。110例胃癌患者中，男69例，女41例，年龄27～82岁，平均(54.3±5.4)岁；>50岁68例，≤50岁42例。

1.2试剂 (1)免疫组织化学试剂：鼠抗人Cx43、P-Ezrin 一抗抗体、免疫组织化学MaxVision试剂盒和即用型DAB显色试剂盒(DAB-0031)购自福州迈新公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、苏木素、伊红等常规试剂购自北京化学试剂公司。(2)Western blot所用试剂：兔抗人一抗Cx43及P-Ezrin 抗体购自Bioword Technology公司，羊抗兔HRP标记的二抗购自KPL试剂公司，RIPA组织裂解液(BB120031)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、BCA蛋白浓度测定试剂盒及ECL超敏发光液均购自北京索莱宝科技有限公司，30%丙烯酰胺、10%过硫酸铵、显影粉等均由承德医学院基础研究所分子实验室提供。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学 石蜡包埋标本4 μm连续切片，行苏木素-伊红(HE)和免疫组织化学染色。3% H2O2孵育10 min封闭灭活内源性过氧化酶；0.01 mol/L(pH 6.0)枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原10 min；山羊血清工作液37 ℃封闭温育60 min；37 ℃湿盒中滴加适当浓度一抗，温育60 min后4 ℃过夜；酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(二抗)室温孵育15 min；DAB显色，苏木素复染核。PBS替代一抗作为阴性对照，已知正常胃组织的阳性切片作为阳性对照。

1.3.2Western blot 取-20 ℃保存的组织提取总蛋白，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。每孔上样量为20 μg,电泳、转膜、放入含5%脱脂奶粉封闭液中封闭；在装有稀释好的Ⅰ抗杂交袋中过夜，TBST洗膜3次，每次15 min；加Ⅱ抗孵育2 h后用1×TBST洗膜3次，每次5 min，曝光，观察结果。

2 结 果

2.1Cx43与P-Ezrin的免疫组织化学结果 40例对照组的标本中，Cx43阳性率为65.0%(26/40)，显著高于胃癌组19.1%(21/110)。P-Ezrin阳性率为27.5%(11/40)，显著低于胃癌组74.5%(82/110)，两组差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、2，表1。

A:正常胃黏膜强阳性;B:胃高分化腺癌中等阳性;C:胃低分化腺癌弱阳性。

图1不同组织中Cx43表达情况(×400)

A:正常胃黏膜阴性;B:胃高分化腺癌弱阳性;C:胃低分化腺癌强阳性。

图2不同组织中P-Ezrin表达情况(×400)

表1 两组Cx43与P-Ezrin表达情况

表2 Cx43与P-Ezrin的表达与胃腺癌临床病理特征的定性分析

2.2Cx43及P-Ezrin表达分析 在40例对照组的胃组织标本中，Cx43蛋白相对表达量(0.95±0.02)高于胃癌组织(0.12±0.03)，差异有统计学意义(P=0.021)，P-Ezrin蛋白相对表达量(0.29±0.03)低于胃癌组织(2.43±0.05)，差异有统计学意义(P=0.01)，在性别和年龄组中差异无统计学意义(P>0.05)，而在其余各组中的差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、3，图3。

表3 Cx43、P-Ezrin表达与胃腺癌临床特征的定量分析

1:对照组;2:高中分化胃癌组;3:低分化胃癌组。

图3不同组Cx43、P-Ezrin免疫印迹电泳

表4 Cx43与P-Ezrin在胃癌组织中表达的相关分析

2.3Cx43、P-Ezrin在胃癌中的相互关系 Spearman等级相关分析显示免疫组织化学检测结果中Cx43与P-Ezrin在胃癌中的表达呈负相关(r=-0.58，P=0.000),见表4。

3 讨 论

间隙连接是细胞间进行信息交流的特殊膜结构，其功能和结构的基础是间隙连接蛋白。有资料证实，Cx43在多种组织中表达[1]，如上皮细胞、平滑肌细胞、心肌组织等，但在恶性肿瘤组织中却表达减少甚至缺失[2-5]。本试验结果显示，癌旁组织中Cx43蛋白表达远高于胃癌组织，且进一步发现其表达与患者年龄及性别无关，而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、临床分期有关，提示Cx43的缺失可能促进胃癌的发生发展。

Ezrin是参与细胞膜和细胞骨架连接的一种特定蛋白[6]。磷酸化作用使Ezrin构象发生改变而激活，P-Ezrin介导后续的病理生理过程。Ezrin在将肌动蛋白丝与细胞膜相连的同时，会产生一系列细胞功能，如细胞的形态改变、移动、信号转导、黏附、有丝分裂等，从而影响了肿瘤侵袭转移等生物学行为。因此，越来越多的研究证实，Ezrin在多种肿瘤中存在高表达[7-10]，与本试验研究结果相一致。在进一步探讨P-Ezrin表达与恶性肿瘤临床病理特征关系中，多项研究发现P-Ezrin与多类恶性肿瘤的发生、浸润及转移密切相关[11-12]，且肿瘤细胞的浸润和转移能力在P-Ezrin低表达时受到抑制，反之则增强。显示P-Ezrin是肿瘤转移的关键因素，并且是预后差的指标[13-14]。本试验结果显示P-Ezrin在胃癌中的表达与患者性别和年龄无关，而与胃癌的生物学行为密切相关，低表达者分化程度高、淋巴结转移少、肿瘤浸润深度浅、临床分期低。进一步证实了P-Ezrin在参与了胃癌的发生过程，有高侵袭和转移倾向。

Cx43在胃癌组织中的表达明显下降，P-Ezrin的表达则明显增加，二者呈负相关关系，这可能是由于P-Ezrin自身或通过激活各种信号分子导致 Cx43 磷酸化，从而破坏了细胞间的通信功能，导致细胞间生长控制减弱，这种细胞内和细胞间的信号传导作用，可能是胃癌发生发展的机制之一，可能成为胃癌药物治疗的潜在作用靶点，但具体机制还有待于研究。

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