对虾白斑综合征病毒新株型WSSV-CN-Pc的毒力研究

李 凯， 江录志， 夏文旭， 潘迎捷,2,3， 王永杰,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)是一种具囊膜、杆状、双链环状DNA病毒，属于Nimaviridae科Whispovirus属[1-2]。WSSV是造成对虾养殖过程中大量死亡的最主要病源，自20世纪90年代爆发以来，已经传播到世界上主要的对虾养殖地区包括东亚和东南亚、美洲、印度、中东甚至欧洲[3]，严重威胁着对虾养殖业的可持续发展。科研人员至今尚未找到防治该病毒的有效方法。WSSV宿主范围广泛，除了可以感染一些重要的商业养殖对虾，龙虾、螯虾和蟹均可以成为其宿主[4]。不同宿主对其敏感性存在差异。一般而言，南美白对虾(Litopenaeusvannamei)对WSSV极其敏感[5]，而螯虾(P.clarkii,Cheraxquadricarinatus)对WSSV的侵染表现出一定的抗性[6-7]。有研究发现罗氏沼虾(M.rosenbergii)无论通过肌肉注射还是经口注射，WSSV都不能使其感染[8-9]。WSSV存在多种分离株，不同分离株对同一宿主的毒力也有差异。对两种不同的对虾(L.vannamei、Farfantepenaeusduorarum)分别注射6种不同WSSV毒株(中国株、印度株、泰国株、美国德克萨斯株、美国南卡罗来纳州株、美国国家公园螯虾分离株)，结果发现这6种分离株对L.vannamei的毒力存在差异[10]。美国国家公园螯虾分离株表现出毒力最弱，而德克萨斯株毒力最强。研究结果还表明，与L.vannamei相比F.duorarum(juveniles)对这6种分离株有一定的抗性[10]。2005年，Marks等[11]研究发现，针对对虾(Penaeusmonodon)，WSSV-TH (293 kb)型比WSSV-TH-96-II (312 kb)型毒力更强。本研究从克氏原螯虾(P.clarkii)中分离出一种新的WSSV分离株(WSSV-CN-Pc)，采用肌肉注射和经口注射分析其对克氏原螯虾和罗氏沼虾的毒力。研究结果有助于认识不同WSSV分离株的毒力差异以及WSSV的环境传播机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 克氏原螯虾(P.clarkii)由江苏省苏州市养殖户提供；沼虾(M.rosenbergii)由上海市浦东新区新城镇当地养殖户提供；WSSV-TW病毒液由台湾成功大学罗竹芳教授提供；WSSV-CN-Pc病毒液由本实验室纯化获得；WSSV检测的标准质粒由本实验室制备[12]。

1.1.2 试剂与仪器 1 mL无菌注射器(29号针头)(生工生物工程(上海)股份有限公司)；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324)(天根生化科技(北京)有限公司)；SYBR Green qPCR Mix(罗氏诊断产品(上海)有限公司)；Tris、盐酸、MgSO4(生工生物工程(上海)股份有限公司)；ABI 7500 Fast qPCR仪。

1.2 方法

1.2.1 实验动物养殖 250只克氏原螯虾(体长(13±0.1) cm，重量(35±0.5) g)在50 cm×38 cm×25 cm规格的塑料箱中养殖,箱中加20 L曝过气的自来水，保持水温为25 ℃，每天投喂相当于体重5%的饲料,持续暂养2周。在养殖前随机抓取20只克氏原螯虾取其附肢，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取附肢DNA，利用WSSV特异性引物VP28-140引物[12]进行WSSV的qPCR检测。250只沼虾(体长13～15 cm；重量30～45 g)在50 cm×38 cm×25 cm规格的塑料箱中养殖，箱中加30 L曝过气的自来水，保持水温为20 ℃，每天投喂相当于体重5%的饲料，持续暂养2周。在养殖前随机抓取20只沼虾取其附肢，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取附肢DNA，利用WSSV特异性引物VP28-140引物进行WSSV的qPCR检测。

1.2.2 攻毒实验 ①克氏原螯虾肌肉注射实验：挑选60只活力高，身体无损伤，体长相似的克氏原螯虾分为3组，每组20只。一组肌肉注射(无菌注射器29号针头注射健康克氏原螯虾的第三腹节)WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一组注射WSSV-TW病毒液(107copy/μL)，最后一组作为对照组注射TM病毒缓冲液。每组每只克氏原螯虾注射200 μL，每天观察2次，收集死亡的克氏原螯虾，计算累计死亡率。持续7 d。重复实验2次。②克氏原螯虾经口注射实验：挑选60只活力高，身体无损伤，体长相似的克氏原螯虾分为3组，每组20只。采用经口注射的方法[13]，一组注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一组注射WSSV-TW病毒液(107copy/μL)，最后一组作为对照组注射TM病毒缓冲液。每组每只克氏原螯虾注射200 μL，每天观察2次，收集死亡的克氏原螯虾，计算累计死亡率。持续18 d。重复实验2次。③沼虾肌肉注射实验：挑选40只活力高，身体无损伤，体长相似的沼虾分为2组，每组20只。一组肌肉注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一组作为对照组注射TM病毒缓冲液。每组每只沼虾注射200 μL，每天观察2次，收集死亡的沼虾，计算累计死亡率。持续7 d。WSSV-TW肌肉注射实验与其过程完全相同，只是在注射时使用WSSV-TW病毒液。④沼虾经口注射攻毒实验：挑选40只活力高，身体无损伤，体长相似的沼虾分成2组，每组20只。采用经口注射的方法，一组注射WSSV-CN-Pc病毒液(107copy/μL)，另一组作为对照组注射TM病毒缓冲液。每组每只沼虾注射200 μL。每天观察2次，收集死亡的克氏原螯虾，计算累计死亡率。持续18 d。WSSV-TW经口注射实验与其过程完全相同，只是在注射时使用WSSV-TW病毒液。

1.2.3 攻毒实验死亡数量统计 每天观察2次,单独收集每个攻毒组中死亡的克氏原螯虾和沼虾，并统计各组中死亡克氏原螯虾和沼虾数量，利用Excel软件作图，计算每个攻毒组的累计死亡率,以证实WSSV-CN-PC毒株的毒力特点。

1.2.4 qPCR检测 攻毒实验中死亡的每只克氏原蛰虾和每只沼虾分别取其30 mg肌肉，步骤完全按照天根海洋动物组织基因组提取试剂盒的操作步骤提取肌肉总DNA；对于实验中未死亡的克氏原螯虾和沼虾取其30 mg肌肉，按照天根海洋动物组织基因组提取试剂盒的操作步骤进行肌肉总DNA提取。采用罗氏公司的SYBR Green qPCR Mix试剂盒与ABI 公司的7500 Fast Real-time PCR 系统进行实时荧光定量PCR反应进行WSSV定量。将提取的肌肉总DNA经梯度稀释至终浓度为0.1～1.0 ng/μL，再将WSSV标准质粒进行10倍梯度稀释，选择108～10 copy/μL 浓度梯度的标准质粒用于荧光定量PCR反应中绘制标准曲线。荧光定量PCR反应体系为20 L，包含2.0 L模板、0.01 mol/L引物VP28-F和VP28-R[12]各0.6 L、10 μL 2×SYBR Green qPCR Mix、6.8 μL ddH2O。qPCR扩增程序：预变性95 ℃10 min；变性94 ℃15 s，40个循环； 60 ℃ 60 s。每个样品3个平行，重复3次。反应结束后，从软件生成的标准曲线中读取并换算出对应样品WSSV基因拷贝数。

2 结果与分析

2.1 克氏原螯虾攻毒实验

根据克氏原螯虾攻毒实验每天死亡数量的统计数据，利用Excel作图，得到图1和图2,克氏原螯虾肌肉注射实验中注射TM缓冲液的阴性对照组在实验观察期内无死亡。注射WSSV-TW病毒液组在实验第2天开始死亡，第6天死亡率达到100%。第一次实验中，注射WSSV-CN-Pc病毒液组实验第2天开始死亡，第6天死亡率达到100%；第二次实验中注射WSSV-CN-Pc病毒液组在实验第3天开始死亡，第6天死亡率达到100%(图1)。

图1 WSSV-CN-Pc克氏原螯虾肌肉注射实验Fig.1 Intramuscular injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the crayfish

克氏原螯虾经口注射实验中阴性对照组在实验观察期内并无死亡。而注射WSSV-TW病毒液组在实验第9天开始死亡，第16天死亡率达到100%。第一次实验注射WSSV-CN-Pc病毒液组在实验第8天开始死亡，第16天死亡率达到100%；第二次实验注射WSSV-CN-Pc病毒液组在实验第9天开始死亡，第16天死亡率达到100%(图2)。

图2 WSSV-CN-Pc克氏原螯虾经口注射实验Fig.2 Oral injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the crayfish

2.2 沼虾攻毒实验

根据沼虾攻毒实验每天死亡数量的统计数据，利用Excel作图，得到图3。沼虾肌肉注射实验中阴性对照组在实验观察期内并无死亡，而注射WSSV-CN-Pc病毒液组在实验第4天开始死亡，第9天死亡率达到100%。

沼虾经口感染实验中阴性对照组在实验观察期内并无死亡，而注射WSSV-CN-Pc病毒液组在实验第12天开始死亡，第19天死亡率达到100%(图3)。

图3 WSSV-CN-Pc沼虾肌肉注射和经口实验Fig.3 Intramuscular and oral injection bioassay of the WSSV-CN-Pc using the M. rosenbergii

2.3 qPCR检测结果

2.3.1 克氏原螯虾攻毒实验检测结果 克氏原螯虾肌肉注射实验中，对阴性对照组中20只活的克氏原螯虾进行WSSV检测， 20只均未检测到WSSV。对WSSV-TW组中所有死亡克氏原螯虾进行WSSV检测，20只克氏原螯虾均检测到WSSV，含量在1.1×107～1.5×108copy/mg。对所有死亡克氏原螯虾进行WSSV检测，40只克氏原鳌虾均检测到WSSV，且含量在1.2×107～1.7×108copy/mg。克氏原螯虾经口注射实验中对20只活的克氏原螯虾进行WSSV检测，20只均未检测到WSSV。对WSSV-TW组中所有死亡克氏原螯虾进行WSSV检测，20只克氏原螯虾均检测到WSSV，且含量在2.2×107～4.5×107copy/mg。对所有死亡克氏原螯虾进行WSSV检测，40只克氏原螯虾均检测到WSSV，且含量在1.3×107～1.1×108copy/mg。

2.3.2 沼虾攻毒实验检测结果 沼虾肌肉注射实验中对20只活的沼虾进行WSSV检测，20只均未检测到WSSV。对所有死亡沼虾进行WSSV检测，20只沼虾均检测到WSSV，且含量在1.8×106～1.2×107copy/mg。沼虾经口注射实验中对20只活的沼虾进行WSSV检测， 20只均未检测到WSSV。对所有死亡沼虾进行WSSV检测，20只沼虾均检测到WSSV，且含量在1.4×106～1.1×107copy/mg。对沼虾进行的WSSV-TW病毒液肌肉注射和经口注射阴性对照组和实验组均未死亡，对所有活虾进行的WSSV检测，除18只实验组沼虾检测到少量的WSSV外，其余均未检测到WSSV。

3 讨 论

本研究中罗氏沼虾无论是经口或者肌肉注射WSSV-TW在实验观察期内均未出现死亡，这与之前的研究结论相符[8-9]。但从克氏原螯虾中分离到的WSSV新株型WSSV-CN-Pc无论是肌肉或经口注射均能造成罗氏沼虾100%的死亡。这表明罗氏沼虾对特定的WSSV株型表现出很强的抗性。例如，研究表明罗氏沼虾存在自身的某些抗性机制可以降低WSSV的VP28蛋白表达，从而对WSSV产生抗性[14]。有趣的是，WSSV-CN-Pc对罗氏沼虾表现出强的毒力。后续工作中，通过比较基因组分析WSSV-TW和WSSV-CN-Pc，找到与病毒毒力差异性相关的遗传信息，进一步探索罗氏沼虾对WSSV的免疫机理。

值得注意的是，运用qPCR对上海浦东对虾养殖场采集的50只罗氏沼虾样品进行WSSV-CN-Pc定量检测。结果表明，50个样品中35个样品(70%)检测出WSSV-CN-Pc，15个样品未给出信号(数据未公开)，说明罗氏沼虾很有可能是WSSV-CN-Pc水平传播的一个重要媒介。鉴于WSSV-CN-Pc对罗氏沼虾表现的强毒力特征，在罗氏沼虾的养殖过程中也应该采取WSSV的预防措施，防止WSSV-CN-Pc的大规模流行爆发。

致谢感谢台湾成功大学罗竹芳教授为本研究提供WSSV-TW病毒。

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