草酸对铜绿假单胞菌NY3降解烃的作用研究

肖 婷， 聂麦茜， 聂红云， 朱洪胜， 乔 琪， 陈 军

(西安建筑科技大学 环境与市政工程学院，陕西 西安 710055)

随着石油及其产品的开发利用，烃类污染问题已经严重影响人类生存环境，致使人类不得不寻求一种经济有效的治理方法。生物降解法因具有低成本、高效、无二次污染等优势而受到广泛关注[1-2]。能降解烃类污染物的微生物种类繁多[3-4]，其中铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作为降解石油烃的优势菌有以下优点[5-9]：①在自然界中分布广泛，且易于从环境中分离；②适应能力强，能以多种烃为碳源和能源进行代谢且有丰富的胞外分泌物；③有代谢烷烃的优势基因，因此具有较好的应用前景。近年来研究发现，小分子有机酸广泛存在于自然界及其各类污染物代谢体系中。好氧微生物降解烃过程中所产生的小分子有机酸可使降解液pH大大降低[10-11]。因此，烃的降解体系中常常有小分子有机酸共存。草酸是最简单的二元有机羧酸，有较强的酸性，是自然环境中微生物酶促反应矿化各类污染物的中间产物[12-16]，也是植物常见的代谢产物，尤其是真菌类的代谢产物[17-18]。研究发现，一些小分子有机二酸作为共代谢碳源时，能促进铜绿假单胞菌对烃类物质降解效率[19]。因此本研究选取草酸作为共代谢碳源，旨在通过实验掌握草酸对铜绿假单胞菌NY3降解烃类物质效果的影响，并对其影响原因、机理做了进一步分析，为利用共代谢机制修复烃类污染问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 铜绿假单胞菌NY3(属于假单胞菌属，革兰阴性菌)，由本实验室分离并鉴定[20]。

1.1.2 试剂和培养基 无机盐培养基制备[21]：NH4NO31 g，磷酸盐缓冲液(K2HPO4·3H2O 81.22 g，NaH2P O4·2H2O 42.9 g)25 mL，微量元素(FeSO4·7H2O 4.5 g/L，CoCl2·6H2O 0.024 g/L,ZnSO4·7H2O 0.418 g/L,MnSO4·H2O 0.258 g/L,NiCl2·6H2O 10.024 g/L,Na2MoO4·2H2O 0.109 g/L,CuCl2·2H2O 0.017 g/L,H3BO30.062 g/L)1 mL，1 mol/L MgSO4·7H2O 0.5 mL，1 mol/L CaCl2·2H2O 0.1 mL，定容至1 000 mL，调pH 7.5。121 ℃灭菌30 min后备用。LB培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，调pH 7.5，溶解于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃灭菌30 min后备用。

1.2 方法

1.2.1 NY3菌种子液的制备 NY3在无菌条件下接种于100 mL的 LB培养基中，31 ℃、150 r/min好氧培养24 h，OD600达到1.6±0.05，备用。

1.2.2 草酸对NY3菌以烃为碳源的生长特性的影响作用 取上述无机盐培养基100 mL于250 mL锥形瓶中，无菌操作下加入150 μL十四烷，外加草酸，使其质量浓度分别达到0.5、1.0、2.5、5.0 g/L，调pH值为(7.5±0.05)，以未加草酸为对照。分别按10%(体积分数)接种。31 ℃、150 r/min恒温培养，定时取样，测定pH并用平板计数法测定活菌数(cfu/mL)(以此表示菌体生长量)。

1.2.3 草酸共存对NY3菌降解十四烷效率的影响 按照1.2.2的方法制得上述5种培养液，于8 h采样，同步测定培养液中菌体的生长量(用平板计数法测定活菌数(cfu/mL))和十四烷的去除率。十四烷萃取方法：用正己烷(30～60 ℃)萃取剩余十四烷，十二烷为内标，两组平行样，利用安捷伦 6890N 单检测器(GC-FID)测定十四烷的降解率。计算方法：十四烷降解率(%)=((十四烷初始浓度-色谱测定的剩余含量)/初始浓度)×100%。

1.2.4 草酸共存NY3菌生长胞外液降解烃类污染物的作用 取上述无机盐培养基100 mL于250 mL锥形瓶中，无菌操作下加入150 μL十六烷，外加草酸，使其质量浓度达到1 g/L，调pH值为(7.5±0.05)，按10%(体积分数)接种，以未加草酸为对照体系。31 ℃、150 r/min恒温培养,24 h后采样离心(4 000 r/min，20 min)，菌体备用，上清液过0.22 μm的水膜得到两种胞外液。取胞外液各10 mL分别加入30 μL的十四烷，仍以150 r/min，31 ℃恒温培养，降解8、24、48 h采样，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待测备用。上述备用的菌体用等体积的无机盐重悬，取重悬菌液各10 mL分别加入30 μL的十四烷，降解8、24、48 h采样，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待测备用。

1.2.5 两种碳源条件下胞外上清液紫外光谱扫描 按照1.2.4方法得到两种胞外液，以纯水为空白用紫外分光光度计进行波长扫描，确定紫外吸收峰区间。

1.2.6 NY3菌胞外液中PCA的相对含量与其降解十四烷效率的关系 按照1.2.2的方法投加十六烷、NY3种子液以及不同浓度草酸，使其质量浓度达到0.5、1.0、5.0 g/L，调pH值为(7.5±0.05)，以未加草酸为对照。150 r/min，31 ℃恒温培养24 h后，按照1.2.4的方法制得胞外液。取胞外液各10 mL分别加入30 μL的十四烷，仍以150 r/min、31 ℃恒温培养，降解12 h采样，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待测备用。取上述胞外液各2 mL过固相萃取柱(SupelcleanTM ENVITM-18 3 mL Tubes )，用1 mL甲醇(色谱级)洗脱，利用液质联用仪测定PCA的含量。

1.2.7 投加PCA对NY3菌胞外液降解十四烷的影响 取上述无机盐培养基100 mL于250 mL锥形瓶中，无菌操作下加入150 μL十四烷，外加草酸，使其质量浓度达到1 g/L，调pH值为(7.5±0.05)，按10%(体积分数)接种。150 r/min、31℃恒温培养。24 h后采样，按照1.2.4的方法离心过膜得到胞外液。在5 mL胞外液中加入10 μL的正十四烷，投加PCA，使其最终质量浓度分别为0.05、0.20和0.50 mg/L。降解12 h采样，按照1.2.3方法用正己烷萃取剩余十四烷，待测备用。

1.2.8 气相色谱测定烷烃的方法和条件[22]用安捷伦6890N单检测器气相色谱仪(FID检测器)测定十四烷去除率。气相条件：5% phenyl Methyl Siloxane HP-5毛细管气相色谱柱(30 m×320 μm×0.25 μm)。载气：99.99%高纯氮气。气相方法：进样口温度250 ℃，分流比50.0∶1。检测器温度300 ℃，氢气流量40 mL/min，空气流量450 mL/min。程序升温：初始160 ℃，保留1 min，再以20 ℃/min升温至260 ℃，保留1 min。

1.2.9 飞行质谱的测定条件[19]质谱条件：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0 min，10%B；1 min，10%B；20 min，90%B；23 min，100%B；23.1 min，10%B。流速0.2 mL/min,柱温40 ℃，样品室温度20 ℃，进样量10 μL。在负离子模式下采集数据，采集范围100～800 m/z。

2 结果与分析

`2.1 草酸对NY3菌以烃为碳源生长特性的影响

草酸对NY3菌以十四烷为碳源生长及发酵液pH变化趋势如图1所示。由图1A可知，当NY3菌以十四烷为唯一碳源时，其活菌数在接种后即迅速增加，并在50 h时达到最大(1.394 8×109cfu/mL)；而当外加草酸质量浓度为0.5、2.5、5.0 g/L时，NY3菌生长均受到不同程度的抑制，仅在草酸质量浓度为1.0 g/L时，NY3菌在50 h生长的活菌数(1.522 4×109cfu/mL)略高于以十四烷为唯一碳源的体系。超过5次重复实验均得到一致结果：共存草酸不能提高NY3菌细胞生长速度。而图1B结果表明，生长液pH变化趋势大致相同。说明草酸共存作用对NY3菌发酵液pH并无显著影响。但34 h后，外加1.0 g/L草酸的体系中，pH下降速度快，说明该体系中烃类降解转化为酸类的速度要快些。

图1 草酸对NY3菌以烃为碳源生长特性的影响Fig.1 Effects of oxalic acid on the growth characteristics of NY3 with hydrocarbon as carbon source A:草酸对NY3菌以十四烷为碳源的生长曲线；B：草酸对NY3菌以十四烷为碳源的产酸特性A：growth curve of oxalic acid against fourteen strains of NY3 bacteria as carbon source；B：Acid production characteristics of oxalic acid against fourteen strains of NY3 bacteria as carbon source

2.2 草酸共存对NY3菌降解十四烷效率的影响

按照1.2.3中的实验方法，测定8 h内NY3菌生长体系中十四烷降解效率，结果如图2所示。由图2可知，各种草酸浓度均对NY3菌降解十四烷有促进作用。

当草酸投加质量浓度为0～1.0 g/L时，NY3菌对十四烷的降解率随投加浓度增加而增加，十四烷去除率最大可提高15.2%；继续增加草酸浓度，NY3菌对十四烷的降解率反而降低。因此，适量草酸促进NY3菌对十四烷的降解率，当其质量浓度为1.0 g/L时，促进最为明显。与8 h相应的NY3菌细胞生长量相比，外加草酸对细胞生长有一定程度的抑制，且抑制趋势与草酸对十四烷降解去除的促进趋势正好相反。当草酸质量浓度为1.0 g/L时，NY3菌的生长受到较大抑制，其生长量最低，比不加草酸时降低约15.3%，但烃降解率却提高了15.2%。

图2 NY3菌以“十四烷+草酸”碳源生长8 h烃去除效率及其细胞生长量相关性Fig.2 The correlation of alkanes removal efficiency and cell growth of NY3 which can metabolize the "tetradecane+oxalic acid" as carbon source after 8 h

2.3 草酸共存NY3菌生长胞外液降解烃类污染物的作用

按照1.2.4中实验方法，NY3菌分别以“C16”和“C16+1.0 g/L草酸”为碳源生长24 h时，离心分离菌体和培养液，分别用该菌体细胞及胞外上清液降解十四烷，降解效率如图3所示。由图3A可知，两种碳源条件下生长的NY3菌细胞，其对十四烷的降解率均随降解时间延长而增加。两种菌体细胞在24 h内对十四烷的降解率并无显著区别，降解48 h时，以“C16+草酸”为碳源生长的菌细胞对十四烷的降解才显示出明显优势。而由图3B可知，利用细胞生长胞外上清液降解十四烷，草酸共存条件下的胞外上清液降解效率明显提高，胞外上清液降解8、24、48 h时，十四烷降解率分别提高了28.0%、28.1%和26.3%，且48 h内这种降解优势几乎未减弱。因此，共存草酸对NY3菌降解十四烷的促进作用主要存在于胞外液中。

图3 草酸共存NY3菌生长胞外液降解烃类污染物的作用Fig.3 The effects of extracellular fluid on hydrocarbon pollutants degradation by NY3 which coexistence of oxalic acidA：两种生长体系中菌体对十四烷的降解率；B：两种生长体系中胞外液对十四烷的降解率。两种生长体系的碳源分别为C16和“C16+草酸”无机盐培养基A：degradation of tetradecane in bacteria of two growth systems；B：degradation of tetradecane in extracellular fluid of two growth systems；The carbon sources of the two growth systems were C16 and ″C16+oxalic acid″ inorganic salt medium respectively

2.4 草酸共存条件下NY3菌生长胞外上清液的特性分析

2.4.1 草酸共存条件下胞外上清液 两种碳源条件下NY3菌生长胞外上清液外观特征如图4所示。由图4可知，以烃(十六烷)为唯一碳源时胞外上清液呈淡绿色；而草酸共存时胞外液则呈很浅的黄绿色。由于NY3菌是一株铜绿假单胞菌，胞外分泌物十分丰富，其胞外分泌的有色物质主要有绿脓菌素(Pyo)、1-羟基吩嗪(1-OH-PHZ)、吩嗪-1-酰胺(PCN)和吩嗪-1-羧酸(PCA)[23]。由于Pyo在pH值为中性时一般为深绿色[7，24]，其颜色深浅与Pyo的浓度相关，因此，共存草酸可能抑制了NY3菌对Pyo的分泌。共存草酸时胞外液呈现的浅黄色与PCA和PCN的颜色一致。据此推测，共存草酸显然改变了NY3菌胞外有色物质的分泌。

图4 草酸共存条件下胞外上清液外观特征Fig.4 The appearance characteristics of extracellular supernatant in the coexistence of oxalic acid

2.4.2 两种碳源条件下胞外上清液紫外光谱图特征 由于NY3菌胞外有色物质均有紫外可见吸收，因此，分别测定了购买的四种吩嗪类物质纯品(Pyo、HPE、PCN和PCA)紫外光谱，同时测定NY3菌在两种生长碳源条件下胞外液的紫外吸收，结果如图5所示。由图5可知，无论草酸共代谢作用是否存在，NY3菌均能分泌出这四种吩嗪类物质。对比两种生长碳源条件下胞外液的紫外光谱，其差别在于225～285 nm之间的吸收峰。其中共存草酸时，胞外上清液在250 nm左右的吸收峰明显高于单一碳源时的情形。对比四种吩嗪类纯品的紫外可见吸收可知，250 nm正是PCA的一个最大吸收峰。因此，共存草酸可提高胞外上清液中PCA的相对含量增加。

图5 两种碳源条件下胞外上清液紫外光谱图特征Fig.5 Ultraviolet spectra of extracellular supernatants from two kinds of carbon sources

2.5 NY3菌胞外液中PCA的相对含量与其降解十四烷效率的关系

按照1.2.7中方法提取胞外聚合物。为进一步验证PCA相对含量增加可明显提高胞外液对烃的降解效率，按照1.2.6方法，NY3菌以“不同浓度草酸+十六烷”生长24 h，离心，收集胞外液，同时测定胞外液中PCA含量和12 h内其对十四烷的降解率，结果如图6所示。由图6A可知，草酸浓度影响胞外液中PCA的含量，而胞外液对十四烷的降解率随胞外液中PCA分泌量呈正相关性。同样的按照1.2.6方法，NY3菌以“1.0g/L草酸+十六烷”生长24h，离心，收集胞外液，分别将不同浓度的纯品PCA加入到NY3菌胞外液中，并测定加入PCA后胞外液对十四烷降解率，结果如图6B所示。图6B结果显示，随着NY3菌胞外液中外加PCA含量的增加，其在相同时间内对十四烷的降解率增加。该结果进一步验证了胞外液中的PCA含量的增加可增加其对十四烷的降解率。

图6 NY3菌胞外液中PCA的相对含量与其降解十四烷效率的关系Fig.6 The correlation between the concentration of Phenazine-1-carboxylic acid in extracellular fluid and the synchronous degradation rate of tetradecanein the metabolic system of NY3 A:草酸共代谢体系胞外液中PCA量与其降解十四烷的关系;B:投加PCA对NY3菌胞外液降解十四烷的影响A:relationship between PCA content in extracellular fluid of oxalate co-metabolism system and degradation of tetradecane;B:the effect of adding PCA on the degradation of tetradecanein by extracellular fluid of NY3 bacteria

3 讨 论

研究表明，自然界中能完全矿化污染物的降解菌占总降解菌数量不到10%，大多数微生物是通过共代谢作用来降解污染物的[25]。课题组前期研究发现，一些有机酸作为共代谢碳源时，能促进铜绿假单胞菌降解烃类物质[19]，但是具体的降解机理研究较少。草酸又名乙二酸，是最简单的二元羧酸，由于分子中是由两个羧基直接相连,它的酸性比其他二元酸都强，同时也是生物体常见的一种代谢产物。本文研究了草酸作为共代谢碳源对铜绿假单胞菌NY3生长及其降解烃类物质的影响，并对其促进降解的具体机理做了初步探索。研究得到以下结论：①草酸共代谢不能促进NY3菌在降解十四烷过程中的细胞繁殖,但可以促进NY3菌对十四烷的降解效率。草酸对NY3菌降解十四烷的促进作用与其对NY3菌细胞生长趋势一致,当草酸质量浓度为10 g/L时,NY3菌细胞生长抑制作用最大,对十四烷降解率的促进作用也最为显著,约可提高15.2%。②草酸共代谢不能显著增加NY3菌细胞对十四烷的降解,但可明显增加NY3菌胞外液对十四烷的降解。与没有草酸共代谢体系相比,草酸共代谢体系的胞外液对十四烷的降解率约提高28%。③草酸可提高NY3菌胞外液中PCA的分泌量,PCA分泌量越高,胞外液对十四烷的降解率越高。外加PCA的NY3菌胞外液对十四烷的降解率随着PCA浓度的增加而增加。因此可以说,草酸可通过促进NY3菌对PCA的分泌而增加其对十四烷的降解效率。

目前研究不仅专注于提高铜绿假单胞菌对烃类物质的降解效果，还对其降解的具体机理进行了初步探索，为优化NY3菌对石油烃污染的环境修复能力提供参考。

参考文献:

[1] 赵鑫,韩研,梁文,等.铜绿假单胞菌生物降解特性的研究进展[J]. 基因组学与应用生物学, 2012,31(40):406-414.

[2] 吕雷,朱米家,王珂.石油污染土壤的生物修复技术研究进展[J]. 安徽农业科学,2014,42(22):7585-7589.

[3] Englert C. Kenzie EJ. Bioremediation of petroleum products in solid [A]. Calabrese EJ, Kostecki PT. Principles and Practices for petroleum contaminated soils[C]. Ann. Arbor.MI, 1992.

[4] Harayama S, Kasai Y, Hara A. Microbial communities in oil-contaminated seawater[J].Environmental Biotechnology, 2004, 15(3):205-214.

[5] Belha A,Desnoues N,Elmerieh C.Alkane biodegradation inPseudomonasaeruginosastrains isolated from a Polluted zone:identifieation ofalkB andalkB-related genes[J].Research in Microbiology,2002,153(6):339-344.

[7] 徐鹏.石油烃代谢菌分泌绿脓菌素对其降解过程的影响作用研究[D]. 西安：西安建筑科技大学, 2013.

[8] O′Malley YQ, Reszka KJ，Spitz DR，et al.Pseudomonasaeruginosapyocyanin directly oxidizes glutathione anddecreases its levels in airway epithelial cells[J]. Eur Biochem,2004,287(1)：94-103.

[9] Reszka KJ, O′Malley Y，McCormick ML, et al. Oxidation of pyocyanin, a cytotoxic product fromPseudomonasaeruginosa, by microperoxidase 11 and hydrogen[J].Free Radic Biol Med, 2004,36(11):1448-1459.

[10] 卢剑.鼠李糖脂在铜绿假单胞菌NY3代谢烃过程中的生理作用研究[D]. 西安:西安建筑科技大学, 2014.

[11] 胡睿.NY3菌发酵碳源对所产Rha特性影响及其对烃降解促进机理研究[D]. 西安:西安建筑科技大学, 2015.

[12] 黄焕林.二噁烷高效降解菌A.baumanniiDD1的降解特性及其群体感应初探[D].杭州：浙江工商大学, 2015.

[13] 李海燕.蒽醌染料的矿化过程及其相关中间产物分析[J]. 安全与环境学报, 2016,16(2):254-257.

[14] 龚丹.蒽醌染料的TiO2光催化降解产物分析及其降解过程研究[D]. 武汉：武汉纺织大学,2013.

[15] 陈小英,刘智武,裘建平,等.紫外-臭氧联合矿化水溶液的活性蓝19染料[J]. 浙江工业大学学报,2010,38(5):486-490.

[16] 李国亭,曲久辉,张西旺,等.光助电催化降解偶氮染料酸性橙Ⅱ的降解过程研究[J]. 环境科学学报,2009,29(1):175-180.

[17] Bary AD. Comparative morphology and biology of the fungi,mycetozoa and bacteria[J]. Nabu Press, 2015.

[18] Foster JW. Chemical Activities of Fungi[M]. New York: Academic Press,1994:648.

[19] 黄璐.铜绿假单胞菌NY3胞外分泌物对烃类降解的作用研究[D]. 西安：西安建筑科技大学, 2015.

[20] Nie M, Yin X, Ren C, et al. Novel rhamnolipid biosurfactants produced by a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteriumPseudomonasaeruginosastrain NY3[J].Biotechnology Advances, 2010,28(5): 635-643.

[21] 樊晓宇,聂麦茜,徐鹏,等.左氧氟沙星对铜绿假单胞菌所产表面活性剂特性的影响作用[J].精细化工,2012,29(3):245-249.

[22] 马霞,聂麦茜,卢剑,等. 鼠李糖脂对铜绿假单胞菌 NY3 表面特性及其烃降解效率的影响[J].环境科学学报,2014,34(10):2462-2468.

[23] Mavrodi DV, Bonsall RF, Delaney SM, et al. Functional analysis of genes for biosynthesis of pyocyanin and phenazine-1-carboxamide fromPseudomonasaeruginosaPAO1[J] Bacteriol,2001,183(21): 6454-6465.

[24] Ernst AH. Friedheim. Pyocyanine, an accessory respiratory pigment[J].Exp.Med,1931,54(2):207-221.

[25] 罗玮. 难降解污染物微生物共代谢作用研究进展[J]. 土壤通报, 2012,43(6):1515-1521.