猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

李 成，张雨迪，黄小波，刘浩宇，刘志鹏，赵玉佳，曹三杰，文心田，文翼平，赵 勤，伍 锐(四川农业大学动物医学院猪病研究中心，成都 611130)

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是近年新发现的一种猪肠道病毒，该病毒属于尼多病毒目(Nidovirales)，冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavirus)[1]。早在2009年我国香港收集的猪直肠拭子中已被检测到，但未分离到该病毒[2-3]。之后在健康的野生鸟类，亚洲豹猫身上也发现了它的身影，也证实该病毒与猪携带的PDCoV有极高的亲缘性[4]。Woo等[1]提出的冠状病毒进化模型主张蝙蝠为α、β冠状病毒的最初基因源，而鸟类为γ、δ冠状病毒的最初基因源，因此δ冠状病毒有可能是由野生鸟类传给小型哺乳动物和家猪。PDCoV与PEDV、TGEV临床发病症状相似，能够引起哺乳仔猪的消化系统疾病，导致猪腹泻、呕吐和脱水，严重者多系统衰竭死亡[5]。目前该病毒已在美国[6]、加拿大[7]、韩国[8]、老挝[9]被检测到，感染的范围正逐步扩大，对养猪业构成严重的威胁。近年，国内的一些流行病学调查结果表明PDCoV在中国大陆的流行较为普遍，检测率高达30%[10-13]，Dong等[14]在2004年存档的安徽样本中检出PDCoV CHN-AH-2004毒株，说明PDCoV早于首次发现时就已存在于中国猪群；吴美洲等[15]对2014年11月至2015年5月之间采集的我国3个省的10个猪场的64份样品进行了检测，PDCoV的检测率为23.4%；2015年3月Song等[16]对我国江西省进行调查，PDCoV的检测率已经达到33.1%。作为新发型传染性病原，需要高度重视和立即加强对PDCoV的研究，降低养猪业带来的损失和威胁。

PDCoV为有囊膜的单链正股RNA病毒，已测定的PDCoV全基因组序列大小约为25.4 kb，是目前已知冠状病毒中基因组最小的[16]。共编码4种结构蛋白，即纤突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白 (M)、核衣壳蛋白(N)和4种非结构蛋白。PDCoV的基因组构成和排列顺序：5′非编码区 (5′UTR)、开放阅读框 1a /1b、S、E、M、非结构蛋白NS6、N、非结构蛋白NS7、3′非编码区(3′UTR)[17]。目前PDCoV的蛋白功能研究较少，根据其他冠状病毒的研究结果推测PDCoV的S蛋白在诱导中和抗体[18]、病毒识别宿主和决定病毒毒力等方面[19]发挥重要的生物学功能。Thachil等[20]利用真核表达系统表达PDCoV的S蛋白，成功建立了检测PDCoV的ELISA方法，该方法的敏感性与特异性分别达到91%、95%，间接证实S蛋白具有良好的反应性。本研究克隆了PDCoV的S1基因，在生物信息学分析基础上，将抗原表位预测区域Sa插入大肠杆菌中进行原核表达，提纯蛋白免疫新西兰大白兔制备了兔抗Sa蛋白高免血清，证明原核表达的Sa蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，为开展S蛋白的应用研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及实验动物 大肠杆菌DH5α和Rosetta(DE3)；pMD19-T质粒、pET22b(+)原核载体由实验室保存；PDCoV阳性病料由本实验室保存；两月龄雌性新西兰兔购自简阳达硕动物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂、材料 PrimeScript RT reagent Kit、HindⅢ、T4DNA ligase均购自大连宝生物工程有限公司；Mouse anti-His单克隆抗体、HRP-羊抗兔二抗、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；PVDF膜购自Millipore公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)购自碧云天公司；普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)购自天根生化科技有限公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1S1基因的克隆 以本实验室保存的PDCoV阳性病料为材料，提取病毒总RNA。采用PrimeScript RT reagent Kit合成单链cDNA,取1 μL产物采用克隆引物(参考CH/Sichuan/S27/2012；GenBank:KT266822.1)进行扩增，上游引物：5′-ATGCAGAGAGCTCTATTGATTATGAC-3′；下游引物：5′-ATAAAAGAAAGTAGGTGTGACAATAG-3′，目的片段大小为1 566 bp。PCR产物经纯化后克隆至pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α中进行氨苄抗性筛选，重组大肠杆菌进行菌落PCR鉴定和序列测定。

1.2.2 生物信息学分析 通过Edit Seq分析测序结果的开放阅读框、蛋白编码、蛋白分子量及等电点。用在线软件signalP3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析S1蛋白信号肽序列，软件分别运用神经网络模型(neural networks，NN) 和隐马尔可夫模型(hiddenMarkov models，HMM)。利用在线软件TMHMM Server v. 2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/ TMH-MM-2.0/)分析S1蛋白跨膜结构。利用DNAStar软件中的Protean软件提供的模块，用Chou-Fasman和Gamier-Rob-son 法分析S1蛋白的二级结构、用 Kyte-Doolit-tle 法分析S1的亲水性，用Karplus-Schulz法分析S1的柔性区域，用Emini法分析S1蛋白的表面可能性。利用DNAStar 软件中的Protean提供的模块，采用Jameson-Wolf法分析鼠S1蛋白的B细胞表位。

1.2.3Sa基因引物的设计及其片段的扩增 参考生物信息软件预测结果，设计一对单酶切同源重组连接表达载体的特异性引物,上游引物：5′-agtgcggccgcaagcttCATAAACCCACGAGTAATTCCA CC-3′,下游引物：5′-gagctccgtcgacaagcttATCAGTGATTACACTAGAAGTGTCT-3′(HindⅢ)，扩增Sa基因106—1 290 bp(36—430 aa),目的片段为1 188 bp,以pMD19-T-S1质粒为模板对Sa基因进行PCR扩增，PCR反应程序：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s；57 ℃ 15 s；72 ℃ 40 s; 34个循环；72 ℃ 8 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4Sa基因原核表达载体的构建与重组蛋白的表达 PCR产物纯化后参照ClonExpressⅡ同源重组克隆试剂盒使用说明书与使用HindⅢ限制性内切酶处理的pET-22b(+)表达载体进行连接。连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性克隆菌落PCR鉴定和上海生工测序。质粒少量提取试剂盒提取测序正确的pET22b-Sa重组质粒转化大肠杆菌感受态Rosetta(DE3)菌株。挑取经PCR验证的阳性菌落，接种至6 mL含120 mg·L-1Amp LB液体培养基的试管中37 ℃、220 r·min-1摇至OD600 nm=0.6，加IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1，37 ℃、220 r·min-1诱导表达5 h。于诱导表达后取菌液5 mL，离心得菌体，加入SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸8 min，12%SDS-PAGE分析，同时取空质粒菌液诱导5 h的产物作为对照。

参考上述方法，取未诱导阳性菌液1 mL接种至200 mL含120 mg·L-1Amp LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37 ℃、220 r·min-1培养至OD600nm=0.6～0.8,加入IPTG至终浓度为0.8 mmol·L-1,诱导表达5 h；12 000 r·min-1离心10 min，菌体用50 mmol·L-1Tris-HCl进行重悬，采用超声破碎的方法，离心后收集上清和沉淀。样品经SDS-PAGE电泳后，转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，经5%脱脂乳封闭，以Mouse anti-His单克隆抗体(1∶5 000)为一抗，羊抗鼠HRP-IgG(1∶7 000)为二抗，通过DAB底物显色进行Western blot鉴定。

1.2.5 Sa蛋白的纯化 对含有目的蛋白的上清液，12 000 r·min-1离心10 min，之后采用0.22 μm滤膜过滤、超滤柱浓缩、Ni柱亲合层析纯化的方法进行纯化，纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.6 兔抗Sa蛋白多克隆抗体的制备 使用BCA蛋白定量试剂盒测定Sa蛋白浓度(3.938 mg·mL-1)，并把蛋白浓度定至 1 mg·mL-1，与等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化，免疫新西兰兔(表1)，制备兔抗Sa蛋白多克隆抗体。免疫前耳静脉采集血液，间接ELISA测定抗体效价。四免10 d后经心脏采血，分离血清，于-20 ℃保存备用。

1.2.7 兔抗Sa蛋白多克隆抗体效价的测定 以纯化的Sa蛋白为包被抗原，37 ℃1 h包被ELISA板 (0.2 μg·孔), PBST洗涤3次 (5 min·次-1, 下同) 后用5%的脱脂奶粉37 ℃封闭1.5 h, PBST洗涤3次, 以兔抗Sa蛋白多克隆抗体为一抗 (1∶1 000～1∶12 800), 37 ℃孵育1 h, PBST洗涤3次,加入HRP标记羊抗兔IgG(1∶5 000), 37 ℃孵育1 h, PBST洗涤3次后加入TMB显色底物, 显色10 min后加入终止液, 酶标仪检测OD值。以免疫血清OD450 nm值与阴性对照血清OD450 nm的比值≥2.1 为阳性判定标准，判定制备的兔抗Sa蛋白多克隆抗体的最低检出效价。

表1免疫程序

Table1Immuneprogram

免疫Immune免疫原Immunogen免疫剂量/μgImmunizationdose免疫途径Immuneroute初次免疫(0d)Sa蛋白+弗氏完全佐剂720背部皮下多点注射二次免疫(初免后10d)Sa蛋白+弗氏不完全佐剂720背部皮下多点注射三次免疫(初免后20d)Sa蛋白+弗氏不完全佐剂720背部皮下多点注射四次免疫(初免后30d)Sa蛋白+弗氏不完全佐剂720背部皮下多点注射

1.2.8 兔抗Sa蛋白多克隆抗体免疫活性的鉴定 将纯化得到的蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，转印到PVDF膜上,然后用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭1 h，TBST漂洗3次，用采集到的兔多抗血清稀释(1∶200)后作为一抗孵育过夜，TBST洗3次，HRP-IgG(羊抗兔)二抗(1∶7 000倍)孵育1 h，TBST洗涤3次，最后加入底物(DAB)，反应5～15 min，观察显色情况；对PVDF膜上的条带进行照相及分析。

2 结 果

2.1 PDCoV-S1基因的克隆

利用克隆型特异性引物对PDCoV-S1基因进行RT-PCR，扩增出了大小约为1 566 bp的cDNA片段，其长度与预期大小相一致(图1)。

M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1～2. S1基因扩增产物； 3.阴性对照M.DNA marker DL2000;1-2. RT-PCR product of S1 gene；3. Control

图1 S1基因的RT-PCR扩增Fig.1 Amplification of S1 gene by RT-PCR

2.2 生物信息学分析

2.2.1S1基因的序列分析 本研究克隆得到PDCoV的S1基因(GenBank No.:KY398009)。经Edit Seq分析表明,S1的cDNA序列含有一个完整1 566 bp的开放阅读框, 编码522个氨基酸,碱基组分分别为A共418个碱基(26.7%)，C共379的碱基(24.2%)，G共275个碱基(17.6%)，T共494个碱基(31.5%)。氨基酸的等电点为6.15，蛋白质的相对分子质量为57.8 ku。通过与CH/Sichuan/S27/2012毒株S1基因进行比对，仅有碱基位点突变存在，没有碱基的插入与缺失。

2.2.2 S1蛋白跨膜结构的分析 SignalP4.1软件分析信号肽切割位点，预测方法为神经网络(neural network)，结果显示(图2A)该蛋白序列含有一个信号肽切割位点，位于19、20位氨基酸之间(KFA19-D20D)。将推导的蛋白氨基酸序列运用TMHMM server软件预测跨膜区，分析结果(图2B)表明该蛋白非跨膜蛋白。

2.2.3 S1蛋白二级结构结构预测 Chou-Fasman 法预测S1蛋白α螺旋结果显示，S1蛋白骨架可形成多个α螺旋，位置分别在第18—20、36—40、231—240、289—290、300—302、321—324、341—344 区段；用 Gamier-Robson法预测的α螺旋结构较Chou-Fasman方法预测的数量少，但结果基本一致(图3A)。Kyte-Doolittle 法分析S1的亲水性结果显示，S1蛋白分子亲水性区域的分布不均匀，亲水区域占整个蛋白的多数部分，为亲水蛋白 (图3B)。Karplus-Schulz法分析S1的柔性区域结果显示，S1蛋白含有较多的柔性区域，主要集中在蛋白第 19—21、36—50、58—64、68—76、82—88、94—98、106—111、123—124、136—138、146—150、158、168—170，174—177、182—185、191—196、201—204、225—228、242—243、249—255、260—263、270—274、282—286、290—294、298—303、320区域(图3C)。Emini法对S1蛋白表面可能性预测的结果显示，S1蛋白的氨基酸表面可能性区域主要是第2—7、10—12、46—50、55—63、84—89、120—124、130—135、180—191区段，其他区段展示的表面可能性较小或表现为负值(图3D)

图2 S1蛋白的信号肽分析(A)和跨膜区域分析(B)Fig.2 Signal peptide analysis of S1 protein(A) and transmembrane domain analysis (B)

2.2.4 S1蛋白B细胞表位的预测 Jameson-Wolf法分析S1蛋白潜在的抗原表位位点结果显示，S1蛋白存在15个潜在的B细胞抗原表位，主要集中于40—460 aa的位置。与CH/Sichuan/S27/2012株S1蛋白相比，都具有15个抗原，存在抗原表位氨基酸的变异：37—40 aa由KPTS变为KLTS(图3E)。

2.3 重组原核表达载体pET22b-Sa的鉴定

随机挑取数个Rosetta(DE3)单菌落，经PCR验证其在1 200 bp左右出现特异条带(图4)，其结果与预期相符。菌液扩大培养后抽提质粒送生工生物(上海)股份有限公司测序,测序结果与目的基因一致，说明外源基因已成功转化至大肠杆菌受体菌株中。

A. 蛋白α螺旋结构的预测(Chou-Fasman 法与Gamier-Robson法)；B. 蛋白亲水性的预测(Kyte-Doolittle 方法)；C. 蛋白的柔性区域的预测(Karplus-Schulz 方法)；D. 蛋白表面可能性的预测(Emini方法)；E. 蛋白潜在抗原表位的预测(Jameson-Wolf方法)A. α-Helix prediction (Gamier-Robson and Chou-Fasman models); B. Hydrophilicity prediction (Kyte-Doolittle model); C. Flexible regions prediction (Karplus -Schulz model); D. Surface probability prediction (Emini model); E. Antigenic prediction (Jameson-Wolf model)

图3 S1蛋白的二级结构分析Fig.3 The secondary structure prediction of S1 protein

M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1～3. Rosetta菌液样品 ；4. 阴性对照；5. 阳性对照M. DL2000 DNA marker；1-3. Bacteria samples；4. Negative control；5. Positive control

图4 PDCoV Sa基因鉴定结果Fig.4 Identification results of PDCoV Sa gene

2.4 Sa基因原核表达产物的鉴定

诱导后，目的蛋白在pET22b-Sa上清与包涵体中均有表达，相对分子质量约为46 ku(图5)，将重组Sa蛋白进行Western blot检测，结果显示，pET22b-Sa上清蛋白和包涵体蛋白均在46 ku处有一条目的条带(图6)，说明重组蛋白能与Anti-His-tag反应。

M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 空载 2. 诱导前；3. 诱导后全菌；4. 上清；5. 包涵体M. Protein marker; 1：Rosetta (DE3) light；2：pET22b-Sa not induced; 3. All bacteria after induction; 4. The supernatant fluid protein; 5. Inclusion body protein

图5 重组蛋白质可溶性分析Fig.5 Soluble analysis of Recombinant protein

2.5 Sa重组蛋白的纯化

将上清蛋白离心超滤之后经Ni亲和层析柱纯化得到纯度较高的Sa蛋白(图7)。

2.6 多克隆抗体的制备

兔抗S1蛋白的血清进行间接ELISA检测时，免疫血清OD450 nm值与阴性对照血清OD450 nm的比值≥2.1为阳性判定标准，经计算，此研究制备的兔抗血清效价为1∶10 240(图8),为了检验所制备抗体的特异性，利用纯化后的pET22b-Sa重组蛋白，经Western blot 检测发现所制备的阳性抗血清组在46 ku处存在特异条带；同时，以阴性血清作为阴性对照，未见条带(图9)，这说明所制备的抗血清具有较好的特异性。

M. 蛋白质相对分子质量标准；1.空载；2.诱导前；3.诱导后包涵体；4.诱导后上清；5.诱导后全菌M. Protein marker; 1. Rosetta (DE3) light; 2. pET22b-Sa not induced; 3. Inclusion body protein; 4. The supernatant fluid protein; 5. All bacteria after induction

图6 Sa蛋白的Western blot鉴定(His单克隆抗体)Fig.6 Detection of recombinant protein Sa by Western blot(His mAb)

M. 蛋白质相对分子质量标准；1.全菌；2. 上清；3. 包涵体；4. 洗脱峰1；5. 洗脱峰2；6. 纯化后蛋白M. Protein marker; 1. The total bacteria liquid; 2. Protein in solution; 3. Inclusion body protein; 4. Elution peak for the first time; 5. The second elution peak; 6. Purified protein

图7 重组蛋白的纯化结果Fig.7 Purification of recombinant protein

图8 间接ELISA方法检测兔抗S1蛋白多克隆抗体的效价Fig.8 In-ELISA analysis of positive samples

M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 阳性血清；2. 阴性血清M. Protein marker; 1. Positive antiserum；2. Negative antiserum

图9 多克隆抗体特异性鉴定Fig.9 Polyclonal antibody specificity identification

3 讨 论

PDCoV作为一种新发型病毒性腹泻的致病原，可单独感染仔猪，也可与PEDV、TGEV、PoRV混合感染[21]，引起患病仔猪的死亡，给养殖业带来巨大的损失。S蛋白作为冠状病毒的纤突糖蛋白，在病毒侵袭宿主，决定病毒毒力等方面发挥作用[22]。目前对于PDCoVS基因及功能的研究还十分有限，根据其他猪冠状病毒的研究报道得知，冠状病毒S蛋白缺乏水解位点不能被切割，N端的抗原表位区S1区主要是病毒与细胞受体结合的功能区[23]，C端的膜融合区域S2区与膜融合有关[24]。可以推测PDCoV的S1蛋白包含主要的中和位点以及刺激宿主细胞产生中和抗体的能力[3]。针对PDCoVS1基因在不同毒株间变异性较大的特点[25]，通过对S1基因的序列测定，可以作为诊断鉴别不同毒株的依据。本研究成功扩增出了S1基因，序列全长1 566 bp，编码522个氨基酸，通过与NCBI公布的CH/Sichuan/S27/2012株S1基因相比，虽然在基因序列方面，两株病毒S1基因存在较多点突变，但在B细胞抗原表位预测结果显示，两蛋白在抗原表位上基本一致没有差异，除此之外，它们的糖基化位点也基本一致，证明该病毒在四川的流行并没有发生变异。由结果“2.2.4”对PDCoV CHN-SC2015株S1蛋白的抗原表位预测结果发现该蛋白的抗原表位主要集中Sa区域，综合其他冠状病毒属成员[26]如PEDV的S蛋白抗原表位分布在不含信号肽切割位点的非跨膜区域，最终选择了CHN-2015株S1蛋白的36—430 aa残基用以表达，该蛋白的氨基酸序列均位于S1区域并且不含有信号肽切割位点；目前对于PDCoVS基因及蛋白的结构与功能尚不明确，PDCoV的检测技术还不完善，因此对S蛋白深入研究在该病的治疗和预防等方面有应用前景。本研究中证实Sa(36—430 aa)蛋白存在抗原表位，但不能定义PDCoV抗原表位的准确位置，需要进一步通过试验验证。

大肠杆菌表达系统具有操作简单、周期短、价格低、获得量高等优点，且人们对其基因背景、表达特征的了解比较清楚。虽然存在一些缺陷，如没有翻译后加工的功能，以及表达的蛋白没有足够的生物学活性，但表达产物在与功能活性无关的免疫性质研究中较为理想，故仍然是目前最受欢迎的异源表达系统之一[27]。有研究指出，糖基化蛋白不易于原核表达，根据宿主对密码子的偏爱性优化cDNA 密码子，提高靶蛋白表达水平[28]。试验中pET22b-Sa表达载体转入Rosetta感受态细胞进行诱导表达的表达量不是很高，可能与病毒蛋白本身特性有关，可考虑密码子优化或更换能优于pET-22b(+)的载体用以表达病毒蛋白。在运用间接ELISA的方法检测多抗血清的效价时，Sa蛋白包被时间不够导致测定的多抗效价明显偏低，所以在测定多抗效价过程中应该提前优化测定的条件，防止出现数值的偏差。

通过SDS-PAGE分析证实了重组蛋白主要以上清的形式表达, 使用该重组蛋白作为免疫原免疫健康雌性新西兰大白兔, 成功制备了抗Sa蛋白多克隆抗体, 并且以该抗体为一抗进行蛋白质印迹分析, 证实了Sa蛋白的相对分子质量为46 ku, 以上这些研究结果一方面证明了S1基因抗原表位预测区Sa蛋白具有抗原性, 另一方面也为我们将来进一步研究Sa蛋白的结构和功能奠定了坚实的基础。

4 结 论

克隆了PDCoV的S1基因，在生物信息学分析基础上，将抗原表位预测区域Sa插入大肠杆菌中进行原核表达，提纯蛋白免疫新西兰大白兔制备了兔抗Sa蛋白高免血清，证明原核表达的Sa蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，间接确定该区域存在PDCoV的抗原表位，为开展S蛋白的应用研究奠定了基础。

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