甲氨蝶呤与左乙拉西坦在大鼠体内的相互作用研究

薛朝军，李 倩，支旭然，李 颖，李 宵，董占军,

(1. 河北医科大学研究生学院，河北 石家庄 050017；2. 河北省人民医院药学部，河北 石家庄 050051)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种叶酸拮抗剂，通过抑制二氢叶酸还原酶，阻止癌细胞分裂，用于治疗急性白血病[1]、乳腺癌、绒毛上皮癌等癌症。低剂量甲氨蝶呤用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、硬皮病等自身免疫性疾病[2]。由于缺乏特异的毒性生物标志物，甲氨蝶呤副作用的发生往往是不可预知的，应根据患者疾病的需求选择适当剂量的氨甲喋呤并监测血药浓度。

左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)在临床上主要用于治疗各种癫痫，其机制可能是通过选择性地抑制癫痫样放电，以及与突触囊泡白蛋白2A结合，对突触前突触囊泡释放神经递质产生影响[3]，具体机制目前尚不清楚。左乙拉西坦临床用于4岁以上儿童癫痫患者部分性发作的加用治疗。左乙拉西坦副作用较小，目前临床上进行了左乙拉西坦治疗自闭症[4]、头痛[5]等疾病研究。加拿大卫生部提示，左乙拉西坦和甲氨蝶呤相互作用具有潜在风险。这两种药物合用可能会导致血液中甲氨蝶呤浓度升高，引起可能是致死性(包括突发急性肾衰竭)的严重副作用。文献报道，甲氨蝶呤和左乙拉西坦都是p-gp的底物[6-7]。由于在甲氨蝶呤和左乙拉西坦在临床上存在合用的可能性，而这两药合用后可能会发生相互作用，因此开展此研究，以期为临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1药品与试剂甲氨蝶呤(索莱宝公司，纯度：99%)；左乙拉西坦(J&K Scientific Ltd，纯度：99%)；氨基蝶呤(上海源叶生物有限公司，纯度：99%)；甲醇、乙腈、三蒸水等。

1.2仪器Shimadzu LC-30AD型超高效液相色谱系统(日本岛津公司)；AB Sciex Triple Quad 5500型三重四级杆串联质谱仪(美国AB公司)；Hettich Zentrifuge 1602型高速低温离心机(德国Hettich公司)；KQ3200E 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AB204-S型标准型的分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司) ；XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；Milli-Q纯水仪(默克化工技术有限公司)等。

1.3实验动物健康♂ SD大鼠，体质量(250±20) g，由河北医科大学中实验动物中心提供，生产合格证号:1707095，使用许可证号：SCXK(冀)2013-10003。

2 方法

2.1色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY®UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱温：40℃；自动进样器：4℃；流动相：乙腈(B)、含0.1%甲酸水(A)，梯度洗脱(0 min，5% B; 3.5 min，95% B；4 min，95% B；4.2 min，5% B；4.5 min，stop)；时间：4.5 min；流速：0.2 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2质谱条件离子化源：电喷雾离子源(ESI)，正离检测；气帘气压力为30 kPa；碰撞气压力是8 kPa；喷雾电压是5 500 V；去溶剂温度为600℃；雾化气压力为60 kPa；辅助气压力是60 kPa；入口电压是10 V；碰撞室出口电压为14 V。MTX、LEV和氨基蝶呤(内标)的质谱参数见Tab 1。

Tab 1 Patameters of mass spectrometry

2.3溶液的配制

2.3.1储备液和工作液配制 分别精密称取MTX、LEV适量，放到10 mL棕色的容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成MTX、LEV浓度分别是2.2 mmol·L-1和5.9 mmol·L-1的贮备液，于4℃冰箱储存。用移液枪分别精密吸取MTX、LEV标准品贮备液适量，用50%甲醇水溶液逐级稀释，配制成MTX浓度为11、4.4、2.2、1.1、0.22、0.11、0.022、0.011 μmol·L-1的工作液和LEV浓度为58.8、29.4、11.8、5.88、2.94、0.588、0.294、0.0588 μmol·L-1工作液，备用。精密称取氨基蝶呤(内标)适量置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度线均匀，配制成浓度为0.227 mmol·L-1的内标贮备液，置于4℃冰箱保存。精密吸取氨基蝶呤500 μL，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2.27 μmol·L-1的内标，4℃冷藏，备用。

2.3.2标准曲线和质控样品配制 用移液枪量取5 μL上述配好的工作液，加入45 μL空白大鼠血浆配制MTX和LEV的血浆标准曲线，使得终浓度分别为1.1、2.2、11、22、110、220、440、1 100 nmol·L-1；5.88、29.4、58.8、294、588、1 180、2 940、5 880 nmol·L-1。精密称取MTX和LEV各10.0 mg，按照上述方法配制低、中、高3个质控制(QC)样品，MTX、LEV浓度分别为2.2、110、880 nmol·L-1；11.8、588、4 700 nmol·L-1。

2.4给药方案、样品采集与处理大鼠随机分为3组：1 mg·kg-1MTX组、180 mg·kg-1LEV组、合用组，每组5只。在0、0.16、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、24、48 h眼底静脉丛取血，离心取血浆用于检测；将大鼠饲养于代谢笼，并按分组灌胃给药，于8、24、48 h收集尿液用于检测；按上述分组给药后在1、2、4 h取大鼠肝、肾标本进行HE染色。取血浆、稀释尿液样品50 μL，加入10 μL内标和150 μL甲醇沉淀剂，涡旋2 min，离心(12 000×g，10 min)，取上清液100 μL用于UPLC/MS/MS的测定。血浆和尿液于-20℃冰箱保存待测。

2.5方法学验证

2.5.1专属性 按照“2.3”项下要求，用大鼠的空白血浆，配成1.1 nmol·L-1的MTX和5.88 nmol·L-1LEV血浆样品，与空白血浆经处理后一起分析，观察空白血浆中的成分是否对待测物和内标存在干扰。

2.5.2线性、最低定量限 按照“2.3”项下要求配制标准曲线，以待测物浓度(x)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，并计算标准曲线的线性回归系数(r2>0.99)。最低定量(LLOQ)为标曲的最低点。

2.5.3精密度、准确度 按照“2.3”项下要求配的3个QC浓度的样品，每一浓度6个样本，1 d内同批次处理，连续检测3 d并进行分析，根据当日的标准曲线计算QC样品浓度，评价分析方法的准确度与精密度结果RSD和RE应在± 15%之内。

2.5.4提取回收率、基质效应 按照“2.3”项下要求配制3个QC浓度的血浆样品，每个浓度6个样本，并按照“2.4”项进行处理后进行分析。样本为A。分别取5只大鼠的空白血浆50 mL，加入150 mL甲醇，涡漩1 min后离心(12 000 ×g，10 min)，取上清液45 mL，加入5 mL工作液(相当于甲氨蝶呤2.2、110、880 nmol·L-1；左乙拉西坦11.8、588、4 700 nmol·L-1)，按照“2.4”项处理后，LC-MS/MS测定。样本为B。按照“2.3”项下要求，配的3个QC浓度的工作液，每个浓度6个工作液，并直接进样分析。样本为C。计算公式：提取回收率=A/B；基质效应=B/C。

2.5.5稳定性 稳定性考察是指甲氨蝶呤和左乙拉西坦在血浆样品室温放置4 h、经历3次冷冻、解冻循环和4℃冷藏8 h的稳定性。按照“2.3”项下要求，配制低、中、高浓度的QC血浆样品，每个浓度在每个稳定条件平行6个样本进行分析。储存的样品与新配制样品相比较来证明样品稳定性。用空白大鼠血浆稀释工作液，每一个浓度平行6个样本，考察稀释稳定。样本浓度均在配制浓度的±15%范围，则样品稳定。

2.5.6生物样品的适用性 按照“2.3”项下要求，分别制备3个浓度的QC，每浓度平行6份的稀释尿液样品进行分析。样品浓度的RSD在±15%以内，则该分析方法适用于稀释尿液样品。

3 结果

3.1方法学

3.1.1专属性 血浆样品中，甲氨蝶呤、左乙拉西坦、氨基蝶呤保留时间分别为3.02 min、3.09 min和2.95 min，空白血浆中的内源性物质不干扰测定，方法专属性高(Fig 1)。

3.1.2线性和最低定量限 左乙拉西坦：y=0.061 2x+0.2429 (r2=0.991 9)；线性范围为5.88～5 880 nmol·L-1，最低定量限为5.88 nmol·L-1；甲氨蝶呤：y=0.026 6x+0.462 5 (r2=0.9936)；线性范围为1.1～1 100 nmol·L-1，最低定量限1.1 nmol·L-1。

3.1.3精密度和准确度 甲氨蝶呤和左乙拉西坦的质控样品在日内精密度、日间精密度、准确度都符合生物样本要求(Tab 2)，表明该分析方法的重现性比较好，可用于检测左乙拉西坦和甲氨蝶呤的浓度。

3.1.4提取回收率和基质效应 甲氨蝶呤和左乙拉西坦在3个浓度水平上的提取回收率、基质效应都符合药典规定(Tab 3)。

Fig 1 Representive MRM chromatograms of IS, MTX and LEV

A, D, G:Representative chromatograms blank plasma; B, E, H: Representative chromatograms of blank homogenate spiked with IS, LEV and MTX; C, F, I: Representative chromatograms of plasma sample from pharmacokinetic study after coadministration of LEV and MTX. IS: Aminopurine; MTX: Methotrexatein; LEV: Levetiracetam.

Tab 2 Accuracy and precision of methotrexate and levetiracetam in rat plasma

Tab 3 Matrix effect and extraction recovery of methotrexate and levetiracetam in rat plasma

Tab 4 Stability of levetiracetam and methotrexatein in rat plasma

aPlace 4h at room temperature(25℃)；b4℃ storage for 8 h；c-20℃ refrigeration cycle three times

Tab 5 Dilution effect of methotrexate and levetiracetam in plasma samples

3.1.5稳定性 甲氨蝶呤和左乙拉西坦血浆样品室温放置4 h、经历3次冷冻、解冻循环和4℃冷藏8 h后，稳定性良好，见Tab 4；血浆样品稀释后，甲氨蝶呤和左乙拉西坦的精确度和准确度都满足要求(Tab 5)，表明样品可被稀释。

3.1.6生物样品的适用性 为了分析该方法在稀释尿液样品中的适用性，我们分析了3个浓度的稀释尿液样品，其RSD和RE值满足要求(Tab 6)。

3.2MTX与LEV在大鼠体内相互作用研究

3.2.1药代动力学参数研究 为了探究MTX和LEV在大鼠体内的相互作用，我们进行了大鼠体内的药代动力学试验。MTX和LEV在大鼠体内的药代动力学参数见Tab 7，药时曲线见Fig 2。两药合用后，MTX的Cmax、AUC0-t、Tmax值升高，T1/2、Cl、MRT值下降，各参数差异有统计学意义；LEV的Tmax、T1/2、Cl有一定的上升趋势，AUC0-t有一定的下降趋势，各参数差异无统计学意义。结果表明LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of MTX and LEV in rats

A: Mean plasma concentration-time curves of MTX after oral administration MTX and MEX plus LEV; B: Mean plasma concentration-time curves of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV.

Tab 6 Application of analytical methods in the Urine samples

Tab 7 Pharmacokinetic parameters of methotrexatein and levetiracetam

*P<0.05vsMTX group

3.2.2肾脏排泄研究 为了探究MTX血药浓度升高对肾脏排泄的影响，我们通过代谢笼验证了MTX和LEV单用及合用后大鼠的肾脏排泄水平。在8、24、48及48 h总量4个水平上，与口服单用MTX和LEV组相比，MTX肾脏排泄量在合用组明显增多，而LEV的肾脏排泄量在合用组减少，差异均有统计学意义(Fig 3)。结果表明，LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收，使其血药浓度升高、肾排泄增加。

3.2.3肝肾毒性研究 为了探究MTX血药浓度及尿排泄的增加对肝肾急性毒性的影响，选取给药后1、2、4 h 3个时间点，取老鼠肝、肾组织，经福尔马林溶液固定24 h后，经石蜡切片进行HE染色后。肝脏病理切片结果显示，与对照组相比，MTX组、LEV组肝脏均无明显的病理变化，MTX和LEV合用组肝损伤也不明显，仅在4 h组在肝门静脉附近肝细胞有少量的空泡样变性(红色箭头所示部位，Fig 4)。肾脏病理切片结果显示，与对照组相比，LEV组大鼠肾脏无病理学改变，MTX组大鼠肾脏在肾小球附近部分肾小管可见轻微损伤，表现为颗粒空泡样变性、管腔轻度扩张(红色箭头所示部位)，MTX和LEV合用组肾小管损伤明显增加，表现为肾小管大量的颗粒空泡样变性、部分刷毛缘脱落、部分管腔可见细胞碎片(红色箭头、红色方框所示部位，Fig 5)。结果表明，合用MTX和LEV后大鼠肝肾毒性都明显增加，且肾脏毒性的增加远高于肝毒性。

Fig 3 Renal excretion of MEX and LEV in rats

A: Renal excretion of MEX after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h.*P<0.05vsMTX group; B: Renal excretion of LEV after oral administration MTX and MEX plus LEV at 8 h, 12 h, 24 h.*P<0.05,**P<0.01vsLEV group.

Fig 4 Rats liver pathological slices(HE×200)

Rat liver was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased liver damage significantly.

4 讨论

由于MTX具有抗炎和免疫抑制双重作用[8]，因此在临床应用比较广泛，但其毒副作用也比较明显。2017年3月23日，国家药品不良反应监测中心发布的药物警戒快讯中提到，加拿大卫生部提示LEV和MTX合用可能会导致血液中MTX浓度升高，引起可能是致死性(包括突发急性肾衰竭)的严重副作用[8]。我们的实验证明，LEV明显增加MTX在大鼠体内的吸收，使其血药浓度升高，肾排泄增加，造成明显的肝肾损伤，且对肾脏毒性的影响要明显大于肝脏毒性。有文献报道[9]，LEV可以延长MTX的排泄。本实验结果表明，口服合用LEV与MTX后，MTX的排泄明显增加，而LEV的排泄明显减少。MTX的排泄明显增加可能是因为MTX血药浓度增加的原因，但也不排除LEV与MTX在肾脏发生相互作用的可能。考虑到合用LEV与MTX后，LEV在血药浓度变化无统计学意义的情况下肾脏排泄明显减少，MTX与LEV以肾脏为靶点发生相互作用的可能性是很大的，需要进一步实验来验证两药在肾脏相互作用的机制。本实验结果提示，临床上联合使用LEV与MTX时需要进行剂量调整。

Fig 5 Rats kidney pathological slices(HE×400)

Rat kidney was taken after oral administration LEV, MTX and MTX plus LEV at 1 h, 2 h and 4 h. The red arrow marks the place where the damage occurred. Compared to LEV and MTX group, MTX plus LEV group increased kidney damage significantly.

(致谢：感谢河北省临床医学研究中心/河北省代谢病重点实验室提供大鼠实验的实验室；感谢河北省人民医院病理科康林老师对病理切片结果的指导。)

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