肿瘤代谢物2-HG与胶质瘤发生发展及其检测

陈妍红，陈小平

(中南大学湘雅医院临床药理研究所，湖南 长沙 410008)

恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，好发于儿童和青少年，成人发病率较低，但死亡率高。根据细胞来源的不同，胶质瘤大致可分为星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤，其中星形胶质细胞瘤约占70%～80%。按照恶性程度的不同，世界卫生组织(WHO)将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级和Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ级和Ⅳ级为高级别胶质瘤。目前，胶质瘤标准治疗方法以手术全切为主，结合辅助放化疗。由于恶性胶质瘤侵袭性强，手术难以完全切除，肿瘤细胞易产生放化疗抵抗，患者预后较差[1]。

胶质瘤发病机制复杂，影响其预后的因素较多，随着基因组测序技术的发展，近年来人类对胶质瘤发生、发展的生物学机制和预后影响因素有了更深的认识。

基于大样本的测序结果发现，约80%～90%的Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤患者及多数继发性胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)患者肿瘤组织中存在编码异柠檬酸脱氢酶基因(IDH，包括IDH1、IDH2、IDH3)的体细胞突变。最新中枢神经系统肿瘤治疗指南已将IDH突变列为重要的胶质瘤分型及治疗分子标志物。IDH1突变的主要形式为第132位氨基酸替换，包括R132H、R132C、R132S、R132L、R132G等类型，其中90%为R132H突变。胶质瘤中IDH2的突变频率远低于IDH1，主要包括第172位氨基酸上的3种突变形式(R172G、R172M、R172K)，胶质瘤样本中几乎检测不到IDH3突变。

IDH1和IDH2分别表达于细胞质和线粒体中，主要功能为催化异柠檬酸脱羧生成α-酮戊二酸(a-ketoglutarate，α-KG)，促进NADP+转化为NADPH。IDH1主要在胞质和过氧化物酶体中发挥作用，而IDH2和IDH3参与线粒体三羧酸循环。在过去几年间，包括神经胶质瘤、肉瘤和急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)等多种肿瘤中都发现有IDH1或IDH2的突变，几乎所有的突变都位于异柠檬酸结合位点，突变的IDH催化α-KG代谢生成2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)，从而影响NADPH的生成[2]。IDH1/2突变患者的胶质瘤组织样本中2-HG的含量可达到5～35 mmol·g-1，是正常脑组织中的100多倍。

2-HG包含R-2-HG(D-2HG)和S-2-HG (L-2HG)两种对映体，D-2HG仅由突变IDH催化生成，在低氧环境中，肿瘤细胞常出现L-2HG的累积。2-HG是IDH突变最重要的标志物，其功能研究和体内水平测定对预测胶质瘤患者预后、开发新的靶点药物具有重要的意义。

1 2-HG在神经胶质瘤发病机制和药物反应中的作用

1.12-HG通过表观遗传学调控机制影响胶质瘤的发生发展2-HG与α-KG的结构类似，可竞争性抑制α-KG的作用。研究表明，2-HG在DNA和组蛋白甲基化修饰中发挥重要作用，参与DNA甲基转移酶和组蛋白甲基转移，如10-11位转位蛋白(ten-eleven-translocation，TET)加双氧酶和含Jumonji (JMJ) C结构域的羟化酶，都依赖α-KG发挥功能。临床研究发现，胶质瘤组织中DNA CpG 岛甲基化表型(G-CIMP)与较好的预后相关，目前认为其与IDH突变有关。正常的星形胶质细胞中转染IDH 突变型质粒后，组蛋白3(H3)赖氨酸甲基化(包括H3K9me2、H3K27me3、H3K36me3)水平均明显升高，基因组也呈广泛的高甲基化状态。机制研究发现，外源性D-2HG可明显抑制细胞中DNA去甲基化酶TET2和组蛋白赖氨酸特异的去甲基酶4C (lysine-specific demethylase 4C，KDM4C)的活性，D-2HG抑制KDM4C活性的IC50小于100 μmol·L-1[3-4]。D-2HG处理的胶质瘤细胞株U87MG出现H3K9和H3K79甲基化程度明显升高[5]。Yang等[6]研究发现，2-HG能促进DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)与特定的DNA区域结合，引起抑癌基因启动子高甲基化和表达下调，从而促进肿瘤的发生发展。

近年来，2-HG对AlkB家族蛋白的抑制作用也受到广泛关注。AlkB家族蛋白是一类依赖α-KG的加双氧酶，参与修复烷化剂造成的DNA损伤修复。研究表明，D-2HG可明显抑制AlkB家族同源蛋白ALKBH2和ALKBH3 DNA氧化去甲基酶的活性，导致突变IDH细胞中DNA修复速率下降，DNA损伤增加，对化疗药物的敏感性增加[7]。急性髓性白血病相关研究发现，D-2HG可抑制RNA N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)去甲基酶FTO(fat mass and obesity-associated)的活性，导致细胞内m6A增加，基因组稳定性降低，影响某些重要癌症驱动基因如MYC的表达，从而抑制肿瘤发生、发展(Fig 1)，但其在胶质瘤细胞中的作用还需要进一步验证[8]。

Fig 1 Synthesis and function of 2-HG

1.22-HG对胶质瘤细胞代谢的影响Reitman等[9]对IDH突变的少突胶质细胞瘤细胞株代谢组学研究发现，30 mmol·L-12-HG处理IDH野生型的人少突胶质细胞株，可模拟突变样本体内大部分代谢产物的改变。过表达IDH1-R132H可促进谷氨酰胺经谷氨酸和α-KG向2-HG的转化，导致体内谷氨酰胺耗竭，但外源性2-HG处理的细胞中谷氨酸盐和直接或间接来源于谷氨酸盐的代谢物浓度上升，与体内实验结果相反，提示一些代谢物含量的改变可能与新产生的2-HG无关。1H-磁共振波谱(magnetic resonance spectrum，MRS)对IDH突变肿瘤患者相关代谢物的定量研究发现，突变样本中与细胞膜运输和扩散相关的胆碱复合物Cho的含量升高，复发样本中Cho的相对浓度明显高于初发样本，提示细胞增殖加快；IDH突变样本中谷胱甘肽GSH的浓度下降，可能与2-HG阻断了NADPH的合成有关，NADPH在GSH的合成和体内稳态的维持中具有重要意义。GSH是重要的对抗活性氧和自由基的抗氧化剂，这也可能是2-HG促进肿瘤发生、发展的机制之一[10]。TCGA数据挖掘结果显示，IDH野生型细胞中参与有氧糖酵解(Warburg-effect)相关的基因表达上调，而IDH突变型细胞中乳酸产量少于野生型细胞，位于异柠檬酸上游的三羧酸循环相关基因表达上调[11]，IDH突变导致细胞代谢方式改变的机制尚不清楚。Viswanath等[12]构建了IDH突变的胶质瘤U87细胞和正常星形胶质细胞NHA的模型，发现模型细胞中丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)的活性明显下降，谷氨酸盐生成增加。后期研究发现，应用2-HG处理IDH1野生型的细胞后，细胞内丙氨酸脱氢激酶3(pyruvate dehydrogenase kinase 3，PDK3)活性增加，机制研究发现PDK3能够促进PDH的磷酸化，从而降低PDH的酶活性。

1.32-HG的其他生物学作用除了DNA和组蛋白甲基化修饰酶依赖α-KG的作用，机体内也存在部分加双氧酶，也依赖α-KG发挥功能，其中包括含脯氨酰羟化酶结构域蛋白(prolyl hydroxylase domain-containing proteins，PHDs，也称EGLNs)和胶原蛋白-脯氨酰羟化酶。EGLNs参与介导低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)的降解。研究表明，2-HG能抑制EGLN1的活性，促进人正常星形胶质细胞的增殖，此时HIF-1α作为一个促癌基因。但在低氧环境下，2-HG可通过抑制HIF-1α的降解，增加其稳定性，从而促进肿瘤细胞增殖[13]。此外，研究也发现，D-2HG能够抑制胶原蛋白脯氨酰-/赖氨酰-羟基化，导致胶原蛋白成熟异常，基底膜(basement membrane，BM)的形成受损，从而触发内质网应激反应，改变肿瘤微环境，促进肿瘤发生、发展[14]。

在IDH1-R132Q敲入的突变小鼠细胞中，2-HG能够与细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42，Cdc42)结合，阻碍其与混合谱系酶3(mixed lineage kinase 3，MLK3)的结合，抑制血清饥饿(serum starving，SS)诱导的细胞凋亡所依赖的JNK通路的活化。体外实验发现，在胶质瘤U87 MG细胞中，过表达IDH1-R132H能够明显抑制SS诱导的细胞死亡，IDH1突变特异性抑制剂AGI-5198可逆转这种作用。对TCGA数据库286例低级别胶质瘤患者进行分析，结果显示，携带IDH1-R132H突变患者JNK的底物c-Jun的磷酸化水平明显下降，进一步证明在胶质瘤细胞中，突变的IDH可能通过抑制JNK通路活化，减少SS诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥促癌作用[15]。

2 IDH突变和2-HG对胶质瘤患者预后的影响

IDH突变常见于低级别胶质瘤(low grade glioma，LGG)患者，包括弥漫性低级别和中等级别(WHO Ⅱ和WHO Ⅲ)患者。IDH突变患者常伴有1p及19q联合缺失和TP53突变，TCGA研究小组对293例成人LGG(100例星形胶质细胞瘤、77例少突胶质细胞瘤、116例少突胶质细胞瘤)进行的回顾性研究发现，在少突胶质细胞瘤患者中，IDH突变联合1p及19q缺失患者总生存率高于单纯IDH突变患者，IDH野生型LGG患者的总体生存较突变型胶质母细胞瘤患者更差[16]。Leu等[17]研究发现，在Ⅱ级胶质瘤患者中，IDH突变患者总体生存时间(overall survival，OS)较长，但发展成高级别胶质瘤的比例更高，推测IDH突变可能是WHOⅡ级胶质瘤患者恶性转化的早期事件。此外，IDH突变在不同的组织病理学分类中对预后影响的结果不一致，如在星形胶质细胞瘤患者中，OS与IDH突变状态无明显关联性；而在少突胶质细胞瘤及少突胶质细胞瘤患者中，IDH突变提示较好的预后，且IDH突变的少突细胞瘤患者的OS明显长于星形胶质细胞瘤患者。Houillier等[18]发现携带IDH突变的LGG患者对替莫唑胺更为敏感，但对无进展生存期(progress free survival，PFS)无影响。在复发的胶质母细胞瘤患者中，IDH突变与OS和PFS相关，IDH突变联合编码O-6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)基因启动子甲基化能够更好地预测患者对替莫唑胺的敏感性[19]。2-HG可以作为IDH突变的替代指标，其含量检测可能对患者预后及治疗手段选择具有一定的提示作用。

目前，一些靶向IDH的特异性抑制剂，包括IDH305(突变IDH1抑制剂)、AG881(泛-突变IDH1，IDH2抑制剂)、AG120(突变IDH2抑制剂)、AG221(突变IDH2抑制剂)正处于早期临床研究阶段，一些药物在治疗IDH突变的初发和复发胶质瘤患者方面取得很好的效果，但还待于更大样本中进行验证。临床前研究发现，几乎所有的IDH突变靶向抑制剂都能降低肿瘤细胞中2-HG的含量，所以开发有效、精确的2-HG检测方法，对新药开发、药物临床效果监测具有重要的意义。

3 胶质瘤组织中2-HG的检测方法研究

最初通过比较过表达突变型和野生型IDH1质粒的U87-MG细胞的代谢物，应用LC-MS-MS技术鉴别和定量两者差异代谢产物2-HG。福尔马林固定的石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)的胶质瘤病理组织在甲醛固定及脱水的过程中，2-HG会大量损失。Sahm等[20]发现利用同位素标记的戊二酸(glutaric aciduria，GA)作为内参，气相色谱/质谱(GC-MS)联用法能较为准确地测定FFPE样本中2-HG的水平，并可区分IDH突变和野生型样本。大部分野生型样本中2-HG/GA < 5，而突变型样本2-HG/GA>15，但不同IDH突变类型的组织标本中2-HG的含量存在差异。然而，也有一些IDH1野生型样本出现较高的2-HG水平，这可能与其他相关代谢酶的突变有关。

Pope等[10]应用3 Tesla短回波时间(TE = 30 ms)MRS在术前检测患者体内2-HG的含量，波峰位于约2.25 ppm处，具有较好的灵敏度。但由于2-HG与谷氨酸盐(Glu)、谷氨酰胺(Gln)结构十分相似，一维MRS出现峰形重叠，可能造成假阳性，因此特异性较差。对手术切除样本中2-HG进行LC-MS检测，发现其结果与MRS结果有较好的相关性，突变与野生型肿瘤细胞2-HG含量有显著差异。Emir等[21]在7 Tesla场强下，应用1H-MRS检测13例胶质瘤患者肿瘤组织和8例健康志愿者脑组织中2-HG的相对浓度，也显示出较好的特异性，IDH2突变肿瘤细胞中2-HG的相对浓度高于IDH1野生型细胞，但此项研究样本量较小，IDH2的突变频率与人群不符，结果还需要进一步验证。为了更精确地对体内2-HG的含量进行测定，减少结构类似物的干扰，部分临床研究探讨了一些新的光谱检测方法用于2-HG检测的可行性。但有研究发现，13C核磁共振光谱法灵敏度较差，在肿瘤组织代谢物含量检测方面的应用十分有限。Pichumani等[22]向胶质瘤患者脑内输入13C标记的葡萄糖和醋酸盐，通过高分辨率核磁共振波谱分析在手术过程中获得的肿瘤活检样本中相关代谢物的含量，优化2-HG的检测条件。研究结果显示，IDH突变患者的肿瘤组织切片，在pH为6.0、低温冷却的条件下检测质子解耦13C光谱，能够得到2-HG最佳的谱图。13C-MRS的运用为研究突变肿瘤细胞2-HG相关的代谢通路提供了重要的技术手段。

在胶质瘤细胞株U87过表达IDH1-R132H和IDH-WT质粒的小鼠同位移植模型中，也观察到相似的结果。MRS结果显示，突变型肿瘤组织中可看到明显的2-HG代谢产物峰，野生型细胞中没有，而临床相关的MRI参数(T2和ADC量化)无明显差异。注射过表达IDH1-R132H质粒的肿瘤组织中可观察到广泛的坏死区域，而野生型坏死区域较小，提示2-HG可能促进肿瘤的快速增殖[23]。Navis等[24]在稳定培养的IDH1-R132H突变少突胶质瘤细胞E478提取物中检测到高浓度的D-2HG，但由于组织/间质比率变化，检测浓度的变化很大。为了更准确地定量肿瘤细胞2-HG的量，作者使用液相萃取表面分析(LESA)与高分辨率电喷雾质谱(HR-ESI-MS)联用方法，原位检测代谢物2-HG和α-KG的浓度，结果显示，突变型肿瘤细胞2-HG的含量明显高于野生型和正常脑组织，α-KG的浓度无明显差别。

4 临床应用前景及展望

目前，针对胶质瘤患者血清、尿液和脑脊液中2-HG含量测定的研究还较少。一项基于16例WHOⅡ、Ⅲ级胶质瘤样本的临床研究发现，血清中2-HG的含量与IDH突变及肿瘤的大小无关。而在另一项包含38例IDH1-R132突变患者和46例IDH1-WT患者研究结果表明，野生型与突变型个体间血清及尿液中2-HG含量无明显差别，但突变型患者血清与尿液中2-HG含量的比值明显升高。Fathi等[19]的研究中纳入了16例野生型胶质瘤患者和44例突变型胶质瘤患者，结果发现仅突变型患者尿液中2-HG的含量明显上升。目前关于循环2-HG的研究样本量都较小，且由于循环2-HG的水平受基因突变与否、手术切除程度等多种因素的影响，这可能部分解释目前研究结果的不一致现象。

2-HG的富集是IDH突变肿瘤细胞最明显的代谢改变，多数研究认为2-HG是一种促癌代谢物，在正常大鼠纹状体内注入D-2HG可导致脑内氧化还原稳态破环，引起纹状体组织学改变。2-HG能够降低线粒体凋亡的阈值，在急性髓性白血病模型中增加肿瘤细胞对靶向凋亡通路的化疗药物的敏感性 但在胶质瘤中尚未见相关报道，提示我们靶向凋亡通路联合靶向突变IDH蛋白的抑制剂可能在胶质瘤治疗中具有一定的前景。

虽然2-HG的富集可以解释一部分IDH突变肿瘤细胞的代谢改变，但还有一些细胞过程的改变是不依赖2-HG的，如Tateishi等[25]发现IDH突变细胞对胞内NAD+的含量敏感，抑制NAD+的合成能够诱发自噬，引起细胞死亡，但抑制D-2HG的合成在一些实体瘤模型(包括过表达IDH1-R132H的胶质母细胞瘤肿瘤起始细胞)中不会影响细胞增殖。目前，针对2-HG相对浓度与患者预后、肿瘤体积、级别等临床特征的相关性研究还比较少，已有研究普遍存在样本量少、采样偏倚等问题，降低了这些研究成果的参考价值。随着无创定量检测技术的进步，肿瘤组织中2-HG水平的检测可望在胶质瘤的临床诊断及治疗指导中发挥更重要的价值。

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