耐药性癫痫患者血清和脑脊液P-糖蛋白的表达水平变化及其临床意义

黄华

癫痫是神经内科的常见病、多发病，大部分癫痫患者经合理的用药治疗基本可以控制发作，但仍有约1/3的患者对抗癫痫药物发生耐药，最终不能终止其发作而发展成耐药性癫痫[1-2]。该病的诊治是临床神经内科公认的一大难题，也成为国内外学者的研究热点[3]。耐药性癫痫的发病机制尚不明确，近年来研究认为P-糖蛋白(P-pg)和多药耐药基因(MDR1)的表达异常可能是耐药性癫痫患者耐药的重要原因之一，它们均属于多药耐药转运体，具有药物外排泵功能，可以将细胞内药物泵出细胞外，降低细胞内的药物浓度，从而产生耐药[4-5]。本研究选取本院收治的耐药性癫痫患者作为研究对象，对癫痫患者外周血以及脑脊液中多药耐药基因-1、P-糖蛋白水平进行检测，以探讨这两项指标与癫痫多药耐药的关系，为癫痫患者耐药发生机制的研究以及临床诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月-2016年4月本院收治的耐药性癫痫患者85例作为耐药性癫痫组，所有患者均有典型癫痫发作史及脑电图表现，并符合难治性癫痫的诊断标准，其中男46例，女39例，年龄16～51岁，平均年龄(35.1±10.2)岁，病程3～10年，平均病程(5.1±3.2)年，部分性发作3例，全面强直痉挛发作15例，部分性发作继发全面强直9例，2种或2种以上发作形式18例；选取同期在本院接受治疗的抗癫痫药物治疗控制良好的癫痫患者45例作为治疗有效组，其中男25例，女20例，年龄17～53岁，平均年龄(35.7±11.1)岁，病程3～9年，平均病程(4.8±2.9)年，部分性发作2例，全面强直痉挛发作17例，部分性发作继发全面强直10例，2种或2种以上发作形式16例。另选取体检健康者45例作为健康对照组，其中男20例，女20例，年龄16～50岁，平均年龄(34.9±10.4)岁，所有人员各项体检指标均在正常范围内，均无癫痫发作史和癫痫药物暴露史。研究均是在所有受试人员知情并同意情况下进行。

1.2 纳入标准[6]

耐药性癫痫组患者纳入标准为(1)符合耐药性癫痫的诊断标准，即无中枢神经系统进行性疾病或占位性病变，应用2种以上一线抗癫痫药正规治疗2年以上且药物血浓度在有效范围内，仍不能控制且影响日常生活；(2)除癫痫外，无神经系统疾病病史和家族史；(3)无肝、肾、心脏等重要器官及全身系统性疾病；(4)近半年未应用激素和其他影响免疫的药物。

1.3 P-糖蛋白表达水平检测

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测P-糖蛋白表达水平，检测方法如下：(1)所有受试者于清晨空腹采集静脉血2 mL，同时采集耐药性癫痫组和治疗有效组患者脑脊液2 mL，离心后分别取静脉血和脑脊液上清液，用包被液分别按1∶160和1∶40两种比例稀释，加入到酶标板中，每点2孔，同一板上设阴性对照(加抗原不加一抗)，37 ℃ 3 h或4 ℃过夜，甩去孔中液体；(2)用95%乙醇固定10 min，用洗涤液(0.02 mol/L三羟甲基氨基甲烷-0.05%吐温缓冲液)洗涤3次，每次5 min，甩去孔中液体，每孔加入100 uL非免疫血清封闭，室温放置30 min后弃去上清液，P-GP抗体用稀释液按1∶100稀释，每孔加入100 uL；(3)37 ℃ 1 h或4 ℃过夜，甩去孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次5 min，每孔加入100 μL生物素标记的第二抗体；(4)室温30 min后甩去孔中液体，每孔加入100 uL链霉素抗生素蛋白-过氧化酶溶液；(5)室温30 min，甩去上清液，用洗涤液洗涤3次，每次5 min，每孔加入OPD底物(邻苯二胺、柠檬酸缓冲液、双氧水)，20 min后立即加2 mol/L H2SO4终止反应；(6)将培养板放在Dynatech MR 4000型ELISA读数仪上测OD值，参考波长570 nm，检测波长490 nm。

1.4 MDR1-mRNA表达水平检测

采用荧光定量聚合酶链反应技术检测MDR1-mRNA表达水平。(1)将3 mL全血及脑脊液用 EDTA抗凝，提取白细胞，在白细胞沉淀中加入l mL RNA抽提试剂(Trizol液)，用带针头的注射器反复吹打直至打碎；(2)室温静置5 min后加入氯仿200 uL，用力振摇离心管，于室温放置3 min，13000转/min高速离心15 min，小心移取上层水液500 uL至1.5 mL离心管中；(3)加入500 uL异丙醇彻底混匀，室温放置10 min，使RNA沉淀，13000转/min 4 ℃高速离心15 min，弃去上层液体；(4)向沉淀中加入DEPC处理的75%乙醇l mL，将沉淀吹打悬浮，13000转/min 4 ℃高速离心5 min，弃去上层液体；加入75%乙醇1 mL再次洗涤，再次离心5 min，弃上清液；(5)在无菌室中倒掉乙醇溶液，空气中自然干燥，20 uL DEPC水溶解；(6)参照美国产逆转录试剂盒标准进行cDNA合成，逆转录所得cDNA用作PCR反应的模板，-20 ℃保存备用；(7)引物合成。MDR1基因引物和荧光探针设计为Primer1:5’-GAT ACA TGG TTT TCC GAT CCA TG-3’；Primer2:5’-CAG TGG TGT TTT TTA GGG TCA TCA A-3’；MGB probe：5’-FAM-CAACTCACATCCTGTCTGA-MGB-3’，产物全长69 bp，跨过2个内含子，包括探针结合序列；(8)用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行，PCR反应体积为30 uL，反应体系10×buffer 3 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，上下游引物、荧光探针各0.5 μmol/L，Tag DNA聚合酶1.0 U，cDNA模板3 μL。PCR反应条件为93 ℃ 2 min预变性，然后按93 ℃ 30 s、60 ℃60 s在PE7300荧光定量PCR分析仪上共行40个循环，由电脑自动分析计算MDR1-mRNA表达水平。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 耐药性癫痫组、治疗有效组及健康对照组的血清及脑脊液中P-糖蛋白表达水平

耐药性癫痫组：共85例，血清P-糖蛋白OD值为1.93±0.17，脑脊液P-糖蛋白OD值为2.11±0.38；治疗有效组：共45例，血清P-糖蛋白OD值为0.56±0.08，脑脊液P-糖蛋白OD值为0.74±0.15；健康对照组：共85例，血清P-糖蛋白OD值为0.50±0.11。耐药性癫痫组与治疗有效组、健康对照组比较，耐药性癫痫组患者血清P-糖蛋白表达水平较其他2组均明显增高(P<0.05，P<0.01)，治疗有效组与健康对照组比较，血清P-糖蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)；耐药性癫痫组与治疗有效组比较，脑脊液P-糖蛋白表达水平明显增高(P<0.05)(表1)。

表1 3组血清及脑脊液中P-糖蛋白表达水平,OD)

注：与耐药性癫痫组比较，*P<0.05，△P<0.01

2.2 耐药性癫痫组、治疗有效组及健康对照组的血清及脑脊液中MDR1-mRNA表达水平

耐药性癫痫组：共85例，血清MDR1-mRNA表达水平为(2.21±2.42)×106；脑脊液MDR1-mRNA表达水平为(8.62±9.25)×104，治疗有效组：共85例，血清MDR1-mRNA表达水平为(7.92±8.11)×104，脑脊液MDR1-mRNA表达水平为(9.32±9.75)×102，健康对照组：共85例，血清MDR1-mRNA表达水平为(1.21±2.54)×104。耐药性癫痫组与治疗有效组、健康对照组比较，耐药性癫痫组患者血清MDR1-mRNA表达水平均明显增高(P<0.05，P<0.01)，治疗有效组与健康对照组比较，血清MDR1-mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)；耐药性癫痫组与治疗有效组比较，脑脊液MDR1-mRNA表达水平明显增高(P<0.05)(表2)。

表2 3组血清及脑脊液中MDR1-mRNA表达水平,copies/mL)

注：与耐药性癫痫组比较，*P<0.05，△P<0.01

2.3 耐药性癫痫组中不同发作类型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表达水平

耐药性癫痫组中不同发作类型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表达水平比较均无明显差异(P>0.05)(表3)。

表3 难治性癫痫组中不同发作类型患者血清MDR1-mRNA、P-糖蛋白表达水平)

3 讨 论

耐药性癫痫临床上又称顽固性癫痫，通常指无中枢神经系统进行性疾病或占位性病变，但经2年以上正规抗癫痫治疗，抗癫痫药达到患者能耐受最大剂量，血药浓度达到有效范围，每月仍有4次以上发作，则判断为耐药性癫痫[7-9]。该病的发病原因尚不清楚，可能是多种因素共同作用的结果，目前的研究还没有能够提出一种明确的药理学机制，但耐药性癫痫患者通常对若干种抗癫痫药物都发生耐药，而不是选择性地对某种特殊类型的抗癫痫药不敏感， 这一现象使人们不难推测，在该病的发病机制中存在一种共同的机制[10-12]。借鉴于肿瘤学耐药的研究，人们发现ABC转运蛋白超家族的成员多药耐药基因-1和P-糖蛋白在癫痫患者耐药方面起到了重要作用，它们均属于跨膜药物转运蛋白，具有药物外排泵的功能，可以减少药物在细胞间隙、细胞质和细胞器的聚集[13-14]。P-糖蛋白是多药耐药基因-1的编码产物，在正常人组织中广泛表达，但机体在病理状态下会表达过度，泵出多种达到或已经进入细胞内的药物，使靶细胞内药物浓度降低[15]。本研究结果显示，耐药性癫痫组与治疗有效组、健康对照组比较，耐药性癫痫组患者血清及脑脊液P-糖蛋白及MDR1-mRNA表达水平较其他2组均明显增高，差异均具有统计学意义(P<0.05)，治疗有效组与健康对照组比较，血清P-糖蛋白及MDR1-mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)，这进一步证实多药耐药基因-1和P-糖蛋白与耐药性癫痫患者的耐药存在一定关联。由此提示，外周血及脑脊液中多药耐药基因-1、P-糖蛋白的表达水平可以作为癫痫耐药的一项重要指标，在癫痫患者用药期间要定期检查患者多药耐药基因-1和P-糖蛋白的表达水平，若治疗过程中发现两者表达逐渐升高，则提示要注意耐药的发生，则需医生制定合理的治疗方案，针对性地选择治疗药物，防止因联合用药本身诱导难治性癫痫的产生，降低耐药性癫痫的发生概率。但由于本研究所选样本数量有限，仅为本地区的部分患者，还应在以后的有关研究中扩大选取范围，增加研究样本，以便得到更加科学的实验结果。

综上所述，外周血及脑脊液中多药耐药基因-1、P-糖蛋白的表达水平可以作为癫痫耐药的重要指标。

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