MicroRNA-106a促进乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的机制研究*

刘志平，岳梦琳

(平顶山学院医学院， 河南 平顶山 467000)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势[1]。侵袭是肿瘤的十大特征之一，也是导致乳腺癌患者不良预后甚至死亡的重要原因之一[2]。金属蛋白酶组织抑制物2(tissue inhibitors of metalloproteinase 2，TIMP-2)通路在肿瘤的侵袭中具有极其重要的作用[3]，TIMP-2是基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)的抑制物，而MMP2和MMP9能够降解几乎所有类型的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，促进肿瘤的侵袭[4]。大量研究已经证实，通过降低肿瘤细胞内MMP2和MMP9的表达，可以抑制肿瘤细胞侵袭能力[5]。在多种肿瘤包括乳腺癌中，TIMP-2呈低表达[6]，而具体机制尚不明确。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类长度约22～24 nt的非编码小分子RNA，在基因调控中发挥重要作用，近年来的研究发现微小RNA-106a(microRNA-106a)与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[7]。因此，本研究将探讨microRNA-106a是否通过调节TIMP-2通路，促进乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭，旨在为乳腺癌发生侵袭转移的机制研究提供理论基础。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自Gibco；脂质体Lipofectamine®3000、TRIzol试剂和RNA提取试剂盒均购自Invitrogen；microRNA序列和qPCR引物序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo;兔抗人TIMP-2多克隆抗体和兔抗人GAPDH单克隆抗体均购自Santa Cruz；兔抗人MMP2多克隆抗体和兔抗人MMP9多克隆抗体均购自CST；HRP标记的羊抗兔 II 抗购自上海英基生物科技有限公司；ECL发光液购自Millipore；Matrigel购自上海前尘生物科技有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

二氧化碳培养箱(BB15，Thermo)；超微量核酸蛋白测定仪(ND2000，Thermo)；定量PCR扩增仪(ABI 7500，ABI)；凝胶成像仪(GelDoc-It，UVP)；显微镜(BX61，Olympus)。

2 方法

2.1细胞培养与转染 乳腺癌细胞MDA-MB-231培养于DMEM培养基中(含10% 胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)，37 ℃、5% CO2条件下中培养，取复苏后第4～10代的细胞进行实验。

取4×105个处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，接种于6 cm培养皿中，24 h后采用脂质体Lipofectamine®3000将microRNA-106a抑制物(microRNA-106a inhibitor)、microRNA-106a 模拟物(microRNA-106a mimic)及microRNA无关序列(即阴性对照组,negative control组)转染至MDA-MB-231细胞中，操作步骤参照试剂说明书。取未转染细胞为空白对照组(control组)。

2.2qPCR实验检测转染效率 收集1×105细胞，各细胞样品中加入1 mL TRIzol试剂，抽提细胞总RNA，按照RNA提取试剂盒的说明书操作。超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度及纯度，逆转录试剂盒进行逆转录。MMP2、MMP9、TIMP-2、GAPDH、microRNA-106a及内参照U6的引物序列见表1。定量PCR扩增仪检测microRNA-106a表达水平。qPCR扩增体系为10 μL，反应条件为: 50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示microRNA-106a相对表达量，实验重复3次后，进行统计分析。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for qPCR

2.3Western blot实验检测蛋白表达水平 收集(2～5)×105个细胞，加入RIPA蛋白裂解液，抽提细胞全蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭1 h，TBS-T洗膜，加入兔抗人TIMP2多克隆抗体(1∶2 000稀释)、兔抗人MMP2多克隆抗体(1∶1 000稀释)、兔抗人MMP-9多克隆抗体(1∶1 000稀释)和兔抗人GAPDH单克隆抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBS-T洗膜后，加入HRP标记的羊抗兔 II 抗(1∶10 000稀释)，室温孵育1 h，加入ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪对蛋白条带进行观察，获取图像，并对图像进行灰度分析(Image Lab软件)，记录灰度值，计算目的蛋白与内参照蛋白的灰度比值。实验重复3次后，进行统计分析。

2.4Transwell实验检测细胞侵袭能力 Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 g/L Matrigel 50 μL，在37 ℃、5% CO2培养箱中过夜，使Matrigel凝固；在24孔板下室中加入500 μL的含10% FBS的DMEM培养液，Transwell小室中加入150 μL的细胞悬液(细胞总数约1×105个)；48 h后去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，将Transwell小室置于0.1%结晶紫溶液中，室温染色5 min，去离子水中洗涤后，显微镜下观察，每孔随机选取3个视野拍照(×400)，并记录每个视野的细胞数目。实验重复3次后，进行统计分析。

2.5萤光素酶报告基因实验(luciferase reporter assay)检测基因表达情况 PCR扩增克隆人TIMP-2基因3’非翻译区(3’ untranslated region，3’-UTR)，经限制性内切酶SmaI和KpnI酶切后，插入pGL3-Basic萤光素酶报告基因载体，重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定，构建含有TIMP-2基因3’-UTR的报告基因质粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT，同时构建含有突变TIMP-2基因3’-UTR的报告基因质粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut。

MDA-MB-231细胞接种于24孔板中，融合度在70%～80%时，脂质体共转染microRNA-106a inhibitor(或microRNA-106a mimic)，报告基因质粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT(或pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut或pGL3-Basic空载体)以及pRL-SV40海肾萤光素酶表达载体内参照质粒；每组设3个复孔，重复3次。转染48 h后，采用双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行检测，操作步骤如下：弃去培养液，预冷PBS洗涤细胞3次，每孔加入100 μL PLB裂解液，-80 ℃冰箱裂解1 h，收集细胞裂解液，离心，取上清。EP管中加入10 μL上清，再加入50 μL LAR II，检测萤火虫萤光素酶活性；随后加入50 μL Stop & Glo试剂，检测内参照海肾萤光素酶的活性，两者的比值即为pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT、pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut和pGL3-Basic空载体的相对萤光素酶活性。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两处理效应组间比较采用t检验，多处理效应组间比较采用单因素方差分析，并用Bonferroni校正的t检验进行各组均数间的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MicroRNA-106a inhibitor及microRNA-106a mimic的转染效率

转染microRNA-106a inhibitor 48 h后，细胞内的microRNA-106a表达水平显著低于对照组(P<0.05)；而转染microRNA-106a mimic 48 h后，细胞内的microRNA-106a表达水平明显高于对照组(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The expression levels of microRNA-106a in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1乳腺癌MDA-MB-231细胞内microRNA-106a表达水平

2 MicroRNA-106a对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的促进作用

为研究microRNA-106a对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭影响，在MDA-MB-231细胞中转染了microRNA-106a inhibitor/mimic，随后采用Transwell体外侵袭实验检测了MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化情况。经单因素方差分析显示，4组整体比较差异有统计学意义(F=14.286，P=0.001)。MicroRNA-106a inhibitor组的侵袭细胞数目低于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，microRNA-106a mimic组的侵袭细胞数目高于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学显著性，见图2。

Figure 2. The effect of microRNA-106a on the invasion ability of breast cancer MDA-MB-231cells (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05 control group.

图2MicroRNA-106a对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭能力的影响

3 MicroRNA-106a对TIMP-2通路的影响

qPCR实验结果显示，3组中TIMP-2、MMP2及MMP9的mRNA相对表达量整体比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231细胞内转染microRNA-106a mimic 48 h后，细胞内MMP2和MMP9的mRNA相对表达量高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学显著性；细胞内TIMP-2的mRNA相对表达量低于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学显著性，见图3A。

Western blot实验结果见图3B。单因素方差分析显示，3组TIMP-2、MMP2及MMP9 的蛋白相对表达量整体比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231细胞内转染microRNA-106a mimic 48 h后，细胞内MMP2和MMP9蛋白相对表达量显著高于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学显著性；细胞内TIMP-2蛋白相对表达量显著低于阴性对照组及空白对照组(P<0.05)，阴性对照组与空白对照组之间差异无统计学显著性。

4 萤光素酶报告基因实验检测microRNA-106a对 TIMP-2通路的调控作用

实验结果见图4。3组实验结果经单因素方差分析显示，整体差异显著(F=265.931，P=0.000)。MicroRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT组的相对萤光素酶活性高于microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic空载体对照组和microRNA-106a inhibitor+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut组(P<0.05)；microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT组的相对萤光素酶活性低于microRNA-106a mimic+pGL3-Basic空载体对照组和microRNA-106a mimic+pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR Mut组(P<0.05)。

讨 论

乳腺癌是女性健康的第一杀手，随着不断更新的综合治疗方案的出现，乳腺癌患者的治疗效率得到了很大的提高，然而，侵袭与复发是导致乳腺癌患者不良预后甚至死亡的重要原因之一。探寻导致乳腺癌发生侵袭的内在机制，寻找能够预测甚至逆转肿瘤侵袭的靶标，是临床上亟待解决的问题[8]。

近年来，microRNA调控基因表达的功能受到广泛的关注，有研究表明，microRNA能够调控大约60%的蛋白编码基因[9]。microRNA是由Drosha酶和Dicer酶剪切microRNA前体而来，它能够通过与靶基因mRNA的3’-UTR区结合，在转录水平或者转录后水平，降低靶基因的表达水平，导致疾病的发生发展[10]。Calin等[11]在2002年首次提出了microRNA与肿瘤相关，证实microRNA-15a和microRNA-16-1缺失能够促进肿瘤的发生。目前，愈来愈多的研究证实，microRNA在肿瘤中发挥着类似抑癌基因或癌基因的作用[12-13]。在各种肿瘤组织中，microRNA-106a的异常表达与肿瘤细胞包括乳腺癌细胞的凋亡、侵袭和转移等密切相关，Xiao等[14]在胃癌中的研究表明，microRNA-106a的高表达与肿瘤的分期、分化、淋巴结及远处转移密切相关；Chen等[15]研究证实，microRNA-106a能够促进卵巢癌细胞的增殖和侵袭；而Shin等[7]的研究则表明，在膀胱癌细胞中，microRNA-106a能够通过调节MAPK通路，抑制细胞的增殖与侵袭转移。本研究则分析microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭过程中的作用，并对其内在机制进行初步探讨。

Figure 3. The effects of microRNA-106a on the expression of TIMP-2, MMP2 and MMP9 at mRNA (A) and protein (B) levels in breast cancer MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsnegative control group.

图3MicroRNA-106a对乳腺癌MDA-MB-231细胞中TIMP-2、MMP2以及MMP9的mRNA和蛋白表达的影响

Figure 4. The regulatory role of microRNA-106a in the TIMP-2 pathway investigated by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspGL3-Basic empty vector group;#P<0.05vspGL3-Basic-TIMP-2-3’UTR WT group.

图4萤光素酶报告基因实验检测microRNA-106a对TIMP-2通路的调控作用

我们首先在乳腺癌MDA-MB-231细胞中分别转染了microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic，48 h后细胞内的microRNA-106a水平分别显著地降低和升高。采用Transwell体外侵袭实验探究microRNA-106a与乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力之间的相关性，发现microRNA-106a能够显著增强MDA-MB-231细胞的侵袭能力。ECM是肿瘤侵袭过程中必须突破的障碍，MMP2和MMP9能够降解ECM，促进肿瘤的侵袭，而TIMP-2是MMP2和MMP9的天然抑制剂，TIMP-2增加，将抑制肿瘤的侵袭[16]。在探讨microRNA-106a促进乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的机制研究中，本研究重点关注了TIMP-2信号通路。上调microRNA-106a表达水平后发现，MDA-MB-231细胞内的TIMP-2的 mRNA与蛋白表达水平显著降低，而其抑制底物MMP2和MMP9的mRNA与蛋白表达水平显著增加。采用萤光素酶报告基因试验来研究microRNA-106a是否能够直接调控TIMP-2的表达，实验结果发现，在microRNA-106a inhibitor 和microRNA-106a mimic对报告基因质粒pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性有显著影响，即microRNA-106a inhibitor能够增强pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，而microRNA-106a mi-mic则降低了pGL3-Basic-TIMP-2-3’-UTR WT的活性，证实microRNA-106a能够直接调控TIMP-2的表达。本研究证实，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，microRNA-106a表达增加后，细胞的侵袭能力显著增强，并且高表达的microRNA-106a能够降低MDA-MB-231细胞内TIMP-2的表达，增加MMP2和MMP9的表达；萤光素酶报告基因试验证实，microRNA-106a 能够直接负调控TIMP-2的表达。已有研究证实，microRNA-106a通过调控TIMP-2基因表达，促进胶质瘤干细胞[17]、胰腺癌[18]和胃癌[19]等肿瘤细胞的侵袭迁移。本研究并未对其它与细胞侵袭相关的信号通路和基因进行探讨，在后期研究中，将对microRNA-106a促进乳腺癌细胞侵袭的其它可能机制，进行深入研究。

综上所述，乳腺癌MDA-MB-231细胞中，高表达的microRNA-106a能够通过下调TIMP-2通路，促进细胞体外侵袭能力。microRNA-106a在乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭中发挥着重要作用。

[参 考 文 献]

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