肾茶总黄酮的含量测定

西双版纳州食品药品检验所，云南 景洪 666100

肾茶Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu又名猫须草，傣名“雅糯秒”，全草入药，为傣医常用药，有清火解毒，利尿排石，凉血止血之功[1]。傣药是四大民族医药之一，肾茶是傣医临床常用、疗效确切、具有解毒特色的常用品种，已开发出一些傣药产品如肾茶袋泡剂，取得了良好的经济效益和社会效益。肾茶含有橙黄酮、3′- 羟基-5,6,7,4′-四甲氧基黄酮、α-香树素、、熊果酸、6-甲氧基芫花素、5-羟基- 7 ,3′,4′-三甲氧基黄酮、鼠尾草素、5- 羟基-6 ,7,3 ,4′-四甲氧基黄酮、泽兰黄素、3′- 羟基- 5 ,7,8,4′- 四甲氧基黄酮、异橙黄酮、黄芪苷、异槲皮素、原儿茶醛、原儿茶酸、3,4 -二羟基苯酰甲醇 、迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、秦皮乙素等化合物[2-5]，其中含有的甲氧基黄酮主要是橙黄酮、半齿泽兰素、半齿泽兰素-5-甲醚(结构式见图)。文献报道[6-15]甲氧基黄酮类具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及保护心血管作用，被誉为“天然抗氧化剂”。肾茶的标准收载于《湖南省中药材标准》(2009年版)、《广西壮族自治区壮药质量标准》(第二卷)(DYB45-GXZYCO111-2011)，《云南省中药饮片标准》2005年版第一册。目前，未见对肾茶饮片总黄酮含量测定的报道[16]，按《中国药典》2015年版四部通则[17]建立肾茶总黄酮含量测定方法，为肾茶质量标准的提高及后期产品研发奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2550紫外可见光分光光度仪(岛津)；101-EBS电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)； DZKW-D-6 DIAN水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)； BL310天平(德国赛多利斯集团)；AE200电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2 材料 芦丁对照品(批号：100080-201610，中国食品药品检定研究院)。无水乙醇(分析纯)、氢氧化钠(优级纯)、亚硝酸钠(分析纯)、硝酸铝(分析纯)均为天津市风船化学试剂科技有限公司生产，水为蒸馏水。不同产地的22批药材分别采自云南景洪市、云南勐海县、云南勐腊县、云南普洱市、海南、云南瑞丽、云南元江、福建厦门、广西南宁。由西双版纳州食品药品检验所彭霞主任药师鉴定为唇形科植物肾茶Clerodendranthusspicatus(Thunberg) C. Y. Wu ex H. W. Li 的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品25 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。精密量取20 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含芦丁0.2 mg )。

2.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶l、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在500 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.3 测定法 取本品粉末约0.12 g，置具塞三角瓶中，精密称定，加入50%乙醇溶液100 mL，精密称定，置85℃水浴上回流1 h，放冷，精密称定，用50%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6 mL”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量。按干燥品计算，含总黄酮以芦丁(C27H30O16) 计的量。

2.4 吸收光谱的测定、光谱一致性检测 精密吸取芦丁对照品溶液、供试品溶液各4 mL，分别置25 mL量瓶中，照分光光度法，在200～750 nm波长范围内测定吸收光谱，结果芦丁对照品与供试品光谱吸收图谱基本一致，在500 nm波长处有最大吸收。参照肾茶胶囊中总黄酮的含量测定[18]及《中国药典》(2015年版一部)[19]收载 “山楂叶”中总黄酮的含量测定方法中芦丁的测定波长为500 nm，因此选取检测波长为500 nm。

2.5 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液0.25、0.50、0.75、1、2、3、4、5、6 mL(相当于芦丁1.98090、3.96180、5.94270、7.92360、15.84719、23.77079、31.69439、39.61798、47.54158 μg/mL)，按上述测定法测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标 ，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y= 0.01229X-0.00251，r2=0.9998，试验结果表明芦丁在2～48μg/mL范围内的线性关系良好。

2.6 精密度试验 取同一批号样品6份(产地：西双版纳勐腊县勐满农场，批号：1612312)，按供试品测定方法测定，总黄酮平均含量为17.3%，RSD为0.78%。

2.7 重复性试验 精密量取2.1项下对照品溶液(31.69439μg/mL)，按“2.3”项下方法操作，依次测定7次，以吸收度值计算RSD为0.060%，结果符合要求。

2.8 加样回收率试验 根据《中国药典》2015版四部(通则9101)，药品质量标准分析方法验证指导原则中准确度相关规定，设计同一浓度，9份供试品溶液照2.3方法进行测定，用9个测定结果进行评价。该分析方法的回收率为95.13%～100.01%，且RSD为1.58%，结果符合要求。表明该法准确可靠，可用于肾茶总黄酮含量测定。

2.9 样品测定 取不同产地22批肾茶，按照上述方法制备供试品溶液，分别测定22批样品，按2.2确定的工作曲线，以干燥品计算总黄酮含量，结果见表1。由表2可得，F=5030.293>F0.01(21,22)=2.74，即说明不同产地肾茶中总黄酮的含量差异极显著。

2.10 样品不同部位测定 按照上述方法，分别测定了5批样品的茎和叶总黄酮的含量，按干燥品计算，结果见表3。由表4可得，F=28390.505>F0.01(9,10)=4.95，即说明不同地区肾茶不同部位总黄酮的含量差异极显著。

表1 不同产地肾茶总黄酮的含量 (n=2)

表2 不同产地肾茶总黄酮的含量方差分析结果

注：“*”表示差异达到F0.05显著水平，“**”表示差异达到F0.01极显著水平。

表3 肾茶不同部位总黄酮的含量 (n=2)

表4 肾茶不同部位总黄酮的含量方差分析结果

注：“*”表示差异达到F0.05显著水平，“**”表示差异达到F0.01极显著水平。

3 讨论

3.1 试验条件的考察 试验采用分光光度法以芦丁为对照品，以相应的试剂为空白，分别考察溶剂：甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇；提取方式：回流提取(提取时间分别为60 min、120 min、180 min；回流温度分别为75 ℃、85 ℃、95 ℃)；超声处理(超声时间分别为30 min、45 min、60 min)、振摇提取(振摇时间为120 min温度为65 ℃)、取样量(0.12 g、0.25 g、0.50 g)制备的供试品溶液，在500 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮的含量。结果表明，取样量为0.12 g，50%乙醇为溶剂85 ℃回流提取，肾茶中总黄酮的溶出量最大，回流时间60 min、120 min、180 min肾茶中总黄酮的溶出量变化不大，选择取样量为0.12 g，以50%乙醇为溶剂，提取温度为85 ℃回流60 min制备供试品溶液。

3.2 单因素方差分析 目的是通过分析各样本之间的差异，来检验各样本总体效应之间的差异，从而确定该因素对试验结果是否有显著性影响。由表2可得，F=5030.293>F0.01(21,22)=2.74，即说明不同产地肾茶中总黄酮的含量差异极显著。由表4可得，F=28390.505>F0.01(9,10)=4.95，即说明不同地区肾茶不同部位总黄酮的含量差异极显著。

肾茶含有的甲氧基黄酮类，药理研究表明[6-15]具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、免疫调节及保护心血管作用，肾茶为西双版纳傣族自治州的傣族常用药物，平时代茶饮，用于治疗肾炎、肾结石等疾病，深入研究其质量控制方法显得尤为重要。本实验结果显示不同产地肾茶总黄酮含量差异极显著，不同部位(茎、叶)总黄酮含量差异极显著。本研究建立了分光光度法法测定肾茶中总黄酮的含量，此方法简便、快速、准确，经方法学验证，可作为检验肾茶中总黄酮的含量的一种手段，为肾茶药材的进一步研究提供方法依据。

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